تحليل ترجمة بدء أثناء حالة الإجهاد التي كتبها Polysome التنميط
Summary
هنا، نحن تصف طريقة لتحليل التغيرات في الشروع في ترجمة مرنا من خلايا حقيقية النواة في الاستجابة لنؤكد الظروف. ويستند هذا الأسلوب على سرعة الفصل في التدرجات السكروز من ترجمة ريبوسوم من ريبوسوم غير ترجمة.
Abstract
مراقبة دقيقة من ترجمة مرنا أمر أساسي لتوازن الخلايا حقيقية النواة، وبخاصة في الاستجابة للإجهاد الفسيولوجية والمرضية. تعديلات من هذا البرنامج يمكن أن يؤدي إلى نمو الخلايا التالفة، وهي السمة المميزة لتطور مرض السرطان، أو لموت الخلايا المبكرة مثل ينظر في الأمراض العصبية. لقد تم الحصول على معظم ما هو معروف بشأن الأساس الجزيئي للسيطرة متعدية من تحليل polysome باستخدام التدرج نظام التجزئة الكثافة. تعتمد هذه التقنية على تنبيذ فائق مقتطفات حشوية على الانحدار الخطي السكروز. بمجرد الانتهاء من زيادة ونقصان، ونظام يسمح تجزئة وتقدير من مناطق طرد الموافق مختلفة ترجمة ريبوسوم السكان، مما أدى إلى لمحة polysome. التغييرات في التشكيل الجانبي polysome تدل على تغييرات أو عيوب في الترجمة بدء التي تحدث كاستجابة لأنواع مختلفة من الإجهاد. كما يسمح هذا الأسلوب لتقييم عشر(ه) من دور بروتينات معينة على الترجمة البدء، وقياس النشاط متعدية من mRNAs ومحددة. نحن هنا وصف بروتوكول لدينا لأداء الشخصية polysome من أجل تقييم بدء ترجمة حقيقية النواة الخلايا والأنسجة في ظل ظروف النمو إما طبيعية أو الإجهاد.
Introduction
الخلايا حقيقية النواة تواجه باستمرار مجموعة من ظروف الإجهاد الفسيولوجية والبيئية الضارة التي تتطلب استجابة الخلية على التكيف السريع. يتضمن الاستجابة للضغط النفسي خلية توازن دقيق بين معاداة البقاء والمؤيدة للبقاء العوامل التمثيل. يمكن تعطيل هذا التوازن له عواقب لا رجعة فيه الرائدة في تطوير أمراض الإنسان مثل السرطان وأمراض الاعصاب. خلال الخطوة الأولى من الاستجابة للضغط النفسي، وخلايا تفعيل مسارات مؤيدة للبقاء على قيد الحياة التي تنطوي على السيطرة منسقة من التغيرات في التعبير الجيني على مستوى الترجمة مرنا.
ترجمة مرنا في حقيقيات النوى هو عملية معقدة تنطوي الخلوية التفاعلات بين العوامل منسقة ترجمة بدء (EIFS)، والبروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي محددة (RBDS)، وجزيئات الحمض النووي الريبي 1. وتنقسم الترجمة مرنا إلى ثلاث مراحل متميزة: بدء، واستطالة، وإنهاء الخدمة. على الرغم من جميع هذه المراحل الثلاث تخضع لreguآليات latory، آليات الرقابة متعدية تستهدف في الغالب مرحلة الشروع في الترجمة، والتي بالتالي تشكل خطوة تحد من معدل تخليق البروتين 2.
بدء الترجمة هي عملية أمر غاية التي تبدأ مع تشكيل eIF2a.GTP.Met-الحمض الريبي النووي النقال التقيت معقدة الثلاثي واللاحقة ملزمة تجاه 40S الوحيدات الريبوسوم، مما يؤدي إلى تشكيل مجمع قبل البدء. والخطوة التالية هي تجنيد مجمع preinitiation لمرنا، والذي ينطوي على النشاط من العوامل الترجمة الشروع مثل eIF4F وeIF3. مجمع preinitiation 48S بالتالي شكلت يخضع لتغيرات متعلق بتكوين محددة تمكن هذه الآلات لبدء مسح المنطقة 5'-غير مترجمة من مرنا حتى تعترف بدء كودون أغسطس ثم يتم الإفراج معظم العوامل الترجمة والشروع يتم تجنيد 60S مفارز لتشكيل الريبوسوم 80S معقدة المختصة للترجمة، ور الذي يبدأ تخليق البروتين نقطة (الشكل 1). أكثر من 80S صبغي جنسي أحادي يمكن ترجمة نفس مرنا في وقت إنتاج ما يسمى polysomes (أو polyribosomes). كثافة polysomes على مرنا يعكس بدء، واستطالة ومعدلات إنهاء وبالتالي هو مقياس لترجمتها من نسخة معينة. ومع ذلك، يتم استخدام البيانات الشخصية polysome أساسا لتقييم التغيرات في الترجمة مرنا في خطوة البدء. نحن هنا قد استخدمت مثبطات proteasome والترجمة كما بدء المانع. علاج الخلايا السرطانية مع هذا الدواء يؤدي الى الاستجابة للضغط النفسي تتميز تفعيل كيناز الإجهاد اسمه HRI التي phosphorylates عامل الترجمة الشروع eIF2a 3. الفسفرة من eIF2a هي واحدة من الأحداث الرئيسية التي تؤدي إلى تثبيط الترجمة الشروع في خلايا الثدييات 4.
Protocol
Representative Results
Discussion
التحليل الشخصي polysome على التدرجات السكروز يسمح قياس الترجمة بدء من خلال تحليل كثافة polysomes المعزولة من الخلايا أو الأنسجة 9،11-14. هذا الأسلوب هو أفضل (إن لم تكن فريدة من نوعها) النهج لقياس بدء الترجمة في الجسم الحي. يتم استخدامه لمراقبة حالة متعدية من الخلايا ن?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
السلطة الفلسطينية هي المستفيدة من منحة "بيير دوران" من كلية الطب من جامعة لافال. وأيد هذا العمل من قبل العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (MOP-CG095386) إلى RM وقد حصلت على المجزئ polysome من خلال المؤسسة الكندية للمنحة الابتكار (MOP-GF091050) لرويدة M حاصل على جائزة جديدة CIHR راتب محقق.
نحن ممتنون لالدكاترة. E. Khandjian، I. Gallouzi، S. دي ماركو وA. Cammas للحصول على المشورة المفيدة.
Materials
| Cells | ||||
| HeLa cervical cancer cells | American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC) | CCL-2 | ||
| Schneider Drosophila embryonic cells | American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC) | CRL-1963 | ||
| Culture medium and Supplements | ||||
| Schneider’s Drosophila Medium | Sigma-Aldrich | SO146-500ml | ||
| DMEM | Life technologies | 11995-073 | ||
| FBS | Fisher Scientist Scientist | SH30396-03 | ||
| penicillin/streptomycin | Life technologies | 15140122 | ||
| Sucrose solutions | ||||
| D-Sucrose | Fisher Scientist | BP220-212 | ||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 49767 | ||
| Blue Bromophenol | Fisher Scientist | B3925 | ||
| Lysis buffer | ||||
| Tris Hydrochloride | Fisher Scientist | BP153-500 | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670-100G | ||
| NaCl | Tekniscience | 3624-05 | ||
| DTT | Sigma-Aldrich | D 9779 | ||
| Nonidet P40 (Igepal CA-630 ) | MJS Biolynx | 19628 | ||
| SDS | Tekniscience | 4095-02 | ||
| RNase inhibitor (RnaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor) | Life technologies | 10777-019 | ||
| Antiproteases (complete, mini, EDTA free) | Roche | 11,836,170,001 | ||
| RNA Extraction | ||||
| Proteinase K | Life technologies | AM2542 | ||
| Phenol: Chloroforme | Fisher Scientist | BP1754I-400 | ||
| Chloroforme | Fisher Scientist | C298-500 | ||
| Glycogen | Life technologies | 10814-010 | ||
| Isopropanol | Acros organics | 327270010 | ||
| Antibodies | ||||
| anti-FMRP antibody | Fournier et al., Cancer Cell International, 2010 | |||
| anti-Ribosomal Protein L28 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-50362 | ||
| Others | ||||
| Proteasome inhibitor : Bortezomib | LC Laboratories | B-1408 | ||
| DEPC (Diethylpyrocarbonate) | Sigma-Aldrich | D5758-25ml | ||
| RNaseZAP Solution | Life technologies | AM9780 | ||
| Materials | ||||
| T25 cell culture flask | Corning | 430639 | ||
| 1cc U100 Insulin Syringe 28 G1/2 | Fisher Scientist | 148291B | ||
| Tube ultra-centrifugation, PA, 12ml | Fisher Scientist | FSSP9763205 | ||
| Isco Model 160 gradient former | Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA | |||
| Ultracentrifuge Sorvall OTD Combi | ||||
| Thermo Scientific Sorvall Rotor TH-641 | Thermo scientific | 54295 | ||
| Automated Density Fractionation System | Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA | 67-9000-177 | ||
| Isco UA-6 UV-vis detector | Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA | |||
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo scientific | |||
| Ultracentrifuge C 5415 | Eppendorf | |||
| Optical Microscope | Olympus CK2 | |||
Riferimenti
- Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (10), 827-835 (2004).
- Jackson, R. J., Hellen, C. U. T., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (2), 113-127 (2010).
- Fournier, M. -. J., Gareau, C., Mazroui, R. The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules. Cancer Cell International. 10 (12), (2010).
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 6 (4), 318-327 (2005).
- Mazroui, R., Huot, M. -. E., Tremblay, S., Filion, C., Labelle, Y., Khandjian, E. W. Trapping of messenger RNA by Fragile X Mental Retardation protein into cytoplasmic granules induces translation repression. Human Molecular Genetics. 11 (24), 3007-3017 (2002).
- Mazroui, R., Huot, M. -. E., Tremblay, S., Boilard, N., Labelle, Y., Khandjian, E. W. Fragile X Mental Retardation protein determinants required for its association with polyribosomal mRNPs. Human Molecular Genetics. 12 (23), 3087-3096 (2003).
- Farny, N. G., Kedersha, N. L., Silver, P. a Metazoan stress granule assembly is mediated by P-eIF2alpha-dependent and -independent mechanisms. RNA. 15 (10), 1814-1821 (2009).
- Gareau, C., Houssin, E., et al. Characterization of fragile x mental retardation protein recruitment and dynamics in Drosophila stress granules. PLoS ONE. 8 (2), (2013).
- Brackett, D. M., Qing, F., Amieux, P. S., Sellers, D. L., Horner, P. J., Morris, D. R. FMR1 transcript isoforms: association with polyribosomes; regional and developmental expression in mouse brain. PLoS ONE. 8 (3), (2013).
- Khandjian, E. W., Huot, M. -. E., Tremblay, S., Davidovic, L., Mazroui, R., Bardoni, B. Biochemical evidence for the association of fragile X mental retardation protein with brain polyribosomal ribonucleoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (36), 13357-13362 (2004).
- Erikson, A., Winblad, B., Wallace, W. Translational control of gene expression in the human brain. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 13 (3-4), 469-479 (1989).
- Stephens, S. B., Nicchitta, C. V In vitro and tissue culture methods for analysis of translation initiation on the endoplasmic reticulum. Methods in Enzymology. 431, 47-60 (2007).
- Koritzinsky, M., Wouters, B. G. Hypoxia and regulation of messenger RNA translation. Methods in Enzymology. 435, 247-273 (2007).
- Khandjian, E. W., Corbin, F., Woerly, S., Rousseau, F. The fragile X mental retardation protein is associated with ribosomes. Nature Genetics. 12, 91-93 (1996).
- Sivan, G., Kedersha, N., Elroy-Stein, O. Ribosomal slowdown mediates translational arrest during cellular division. Molecular and Cellular Biology. 27 (19), 6639-6646 (2007).
- Thomas, J. D., Johannes, G. J. Identification of mRNAs that continue to associate with polysomes during hypoxia. RNA. 13, 1116-1131 (2007).
- Kumaraswamy, S., Chinnaiyan, P., Shankavaram, U. T., Lü, X., Camphausen, K., Tofilon, P. J. Radiation-induced gene translation profiles reveal tumor type and cancer-specific components. Ricerca sul cancro. 68 (10), 3819-3826 (2008).
- Fournier, M. -. J., Coudert, L., et al. Inactivation of the mTORC1-eIF4E Pathway alters Stress Granules Formation. Molecular and Cellular Biology. 33 (11), 2285-2301 (2013).
- Sanchez, G., Dury, A. Y., et al. A novel function for the survival motoneuron protein as a translational regulator. Human Molecular Genetics. 22 (4), 668-684 (2013).
- Béchade, C., Rostaing, P., et al. Subcellular distribution of survival motor neuron (SMN) protein: possible involvement in nucleocytoplasmic and dendritic transport. The European Journal of Neuroscience. 11 (1), 293-304 (1999).
- Goulet, I., Boisvenue, S., Mokas, S., Mazroui, R., Côté, J. TDRD3, a novel Tudor domain-containing protein, localizes to cytoplasmic stress granules. Human Molecular Genetics. 17 (19), 3055-3074 (2008).
- Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. Human let-7a miRNA blocks protein production on actively translating polyribosomes. Nature Structural & Molecular Biology. 13 (12), 1108-1114 (2006).
- Genolet, R., Araud, T., Maillard, L., Jaquier-Gubler, P., Curran, J. An approach to analyse the specific impact of rapamycin on mRNA-ribosome association. BMC Medical Genomics. 1 (33), (2008).
- Del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., Müllner, E. W., Garcia-Sanz, J. a Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments. RNA. 13 (3), 414-421 (2007).
- Thoreen, C. C., Chantranupong, L., Keys, H. R., Wang, T., Gray, N. S., Sabatini, D. M. A unifying model for mTORC1-mediated regulation of mRNA translation. Nature. 485 (7396), 109-113 (2012).
- Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., Mcgeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).
- Morris, D. R. Ribosomal footprints on a transcriptome landscape. Genome Biology. 10 (4), (2009).
