Analyse van de translatie-initiatie tijdens stress Voorwaarden door polysome Profiling
Summary
Hier beschrijven we een werkwijze veranderingen in de initiatie van mRNA translatie van eukaryote cellen in reactie stresssituaties analyseren. Deze methode is gebaseerd op de snelheid scheiding op sucrosegradiënten vertalen ribosomen van niet-translating ribosomen.
Abstract
Nauwkeurige controle van mRNA translatie is fundamenteel voor eukaryote cel homeostase, met name in reactie op fysiologische en pathologische stress. Veranderingen van dit programma leiden tot de groei van beschadigde cellen, een kenmerk van kankerontwikkeling of voortijdige celdood zoals gezien in neurodegeneratieve aandoeningen. Veel van wat bekend is over de moleculaire basis voor translationele controlesignalen afkomstig is van polysome analyse met behulp van een dichtheidsgradiënt fractionering systeem. Deze techniek berust op ultracentrifugatie van cytoplasmatische extracten op een lineaire sucrose gradiënt. Wanneer de rotatie is voltooid, maakt het systeem fractionering en kwantificeren gecentrifugeerd zones die overeenkomen met verschillende vertalen ribosomen populaties, hetgeen resulteert in een polysome profiel. Veranderingen in de polysome profiel duiden op wijzigingen of defecten in translatie initiatie die optreden als gevolg van verschillende soorten stress. Deze techniek maakt het ook mogelijk om e te beoordelene rol van specifieke eiwitten op translatie-initiatie, en translationele activiteit van specifieke mRNA's te meten. Hier beschrijven we protocol polysome profielen voeren om translatie-initiatie van eukaryote cellen en weefsels te analyseren onder normale of spanning groeiomstandigheden.
Introduction
Eukaryote cellen voortdurend geconfronteerd met een aantal schadelijke fysiologische en ecologische stress omstandigheden die een snelle adaptieve cel respons vereisen. Cell spanningsreactie impliceert een nauwkeurige balans tussen anti-overleving en pro-survival werkende factoren. Het verstoren van dit evenwicht kan onomkeerbare gevolgen leiden van de ontwikkeling van de menselijke ziekten zoals kanker en neurodegeneratieve ziekten. Tijdens de eerste stap van de reactie op stress, cellen activeert pro-overleving routes die de gecoördineerde beheersing van veranderingen in genexpressie op het niveau van mRNA translatie omvatten.
mRNA translatie bij eukaryoten is een complexe cellulaire proces dat gecoördineerde interactie tussen translatie initiatie factoren (EIFS), specifieke RNA-bindende eiwitten (SGD's), en RNA-moleculen 1 gaat. mRNA translatie is verdeeld in drie afzonderlijke fasen: initiatie, elongatie, en beëindiging. Hoewel alle drie de fasen zijn onderworpen aan Verordeninggevende mechanismen, translationeel controlemechanismen richten meestal de initiatieffase van de vertaling, die dus vormt de snelheidsbeperkende stap van eiwitsynthese 2.
Translatie initiatie is een sterk geordende proces dat begint met de vorming van de eIF2a.GTP.Met-tRNA i Met ternaire complex en de daaropvolgende binding aan de 40S ribosoom subeenheid, leidt tot de vorming van het pre-initiatie complex. De volgende stap is de rekrutering van de preinitiation complex mRNA, die de activiteit van translatie initiatie factoren zoals eIF4F en eIF3 omvat. De aldus gevormde 48S preinitiation complex ondergaat specifieke conformationele verandering die dit mechanisme mogelijk te beginnen met het scannen van de 5'-niet getranslateerde gebied van het mRNA totdat het startcodon AUG herkent. Het merendeel van de translatie initiatie factoren worden losgelaten en 60S subeenheden worden gerekruteerd voor een 80S vormen ribosoom complex bevoegd voor vertaling, eent welk punt eiwitsynthese gestart (figuur 1). Meer dan een 80S monosome kan vertalen hetzelfde mRNA tegelijk produceren van zogenaamde polysomen (of polyribosomen). De dichtheid van polysomen op mRNA weerspiegelt de initiatie, verlenging en beëindiging prijzen en is dus een maat voor de vertaalbaarheid van een bepaald transcript. Echter, polysoom profiel hoofdzakelijk gebruikt om veranderingen in mRNA translatie beoordeeld op de initiatie stap. Hier hebben wij een proteasoom inhibitor translatie initiatie remmer gebruikt. De behandeling van kankercellen met het medicijn veroorzaakt een stressreactie gekenmerkt door activering van de stress kinase genaamd HRI die de translatie initiatie factor eIF2a 3 fosforyleert. Fosforylering van eIF2a is een van de belangrijke gebeurtenissen die leiden tot de remming van translatie initiatie in zoogdiercellen 4.
Protocol
Representative Results
Discussion
De polysome profielanalyse op sucrosegradiënten maakt meting van translatie-initiatie door het analyseren van de dichtheid van polysomen geïsoleerd uit cellen of weefsels 9,11-14. Deze techniek is de beste (zo niet de unieke) benadering van de translatie-initiatie in vivo te meten. Het wordt gebruikt om de translationele positie van groeiende cellen tijdens de celcyclus 15 volgen en de effecten van verschillende soorten stress zoals virale infecties, hypoxie 13,16, 17 straling…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PA is een ontvanger van een beurs "Pierre Durand" van de faculteit geneeskunde van de Universite Laval. Dit werk werd ondersteund door de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (MOP-CG095386) naar RM De polysome fractionator werd verworven door een Canadese Stichting voor Innovatie subsidie (MOP-GF091050) naar RMR M heeft een nieuw CIHR onderzoeker salaris award.
We zijn dankbaar voor Drs. E. Khandjian, I. Gallouzi, S. Di-Marco en A. Cammas voor nuttig advies.
Materials
| Cells | ||||
| HeLa cervical cancer cells | American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC) | CCL-2 | ||
| Schneider Drosophila embryonic cells | American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC) | CRL-1963 | ||
| Culture medium and Supplements | ||||
| Schneider’s Drosophila Medium | Sigma-Aldrich | SO146-500ml | ||
| DMEM | Life technologies | 11995-073 | ||
| FBS | Fisher Scientist Scientist | SH30396-03 | ||
| penicillin/streptomycin | Life technologies | 15140122 | ||
| Sucrose solutions | ||||
| D-Sucrose | Fisher Scientist | BP220-212 | ||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 49767 | ||
| Blue Bromophenol | Fisher Scientist | B3925 | ||
| Lysis buffer | ||||
| Tris Hydrochloride | Fisher Scientist | BP153-500 | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670-100G | ||
| NaCl | Tekniscience | 3624-05 | ||
| DTT | Sigma-Aldrich | D 9779 | ||
| Nonidet P40 (Igepal CA-630 ) | MJS Biolynx | 19628 | ||
| SDS | Tekniscience | 4095-02 | ||
| RNase inhibitor (RnaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor) | Life technologies | 10777-019 | ||
| Antiproteases (complete, mini, EDTA free) | Roche | 11,836,170,001 | ||
| RNA Extraction | ||||
| Proteinase K | Life technologies | AM2542 | ||
| Phenol: Chloroforme | Fisher Scientist | BP1754I-400 | ||
| Chloroforme | Fisher Scientist | C298-500 | ||
| Glycogen | Life technologies | 10814-010 | ||
| Isopropanol | Acros organics | 327270010 | ||
| Antibodies | ||||
| anti-FMRP antibody | Fournier et al., Cancer Cell International, 2010 | |||
| anti-Ribosomal Protein L28 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-50362 | ||
| Others | ||||
| Proteasome inhibitor : Bortezomib | LC Laboratories | B-1408 | ||
| DEPC (Diethylpyrocarbonate) | Sigma-Aldrich | D5758-25ml | ||
| RNaseZAP Solution | Life technologies | AM9780 | ||
| Materials | ||||
| T25 cell culture flask | Corning | 430639 | ||
| 1cc U100 Insulin Syringe 28 G1/2 | Fisher Scientist | 148291B | ||
| Tube ultra-centrifugation, PA, 12ml | Fisher Scientist | FSSP9763205 | ||
| Isco Model 160 gradient former | Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA | |||
| Ultracentrifuge Sorvall OTD Combi | ||||
| Thermo Scientific Sorvall Rotor TH-641 | Thermo scientific | 54295 | ||
| Automated Density Fractionation System | Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA | 67-9000-177 | ||
| Isco UA-6 UV-vis detector | Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA | |||
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo scientific | |||
| Ultracentrifuge C 5415 | Eppendorf | |||
| Optical Microscope | Olympus CK2 | |||
Riferimenti
- Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (10), 827-835 (2004).
- Jackson, R. J., Hellen, C. U. T., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (2), 113-127 (2010).
- Fournier, M. -. J., Gareau, C., Mazroui, R. The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules. Cancer Cell International. 10 (12), (2010).
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 6 (4), 318-327 (2005).
- Mazroui, R., Huot, M. -. E., Tremblay, S., Filion, C., Labelle, Y., Khandjian, E. W. Trapping of messenger RNA by Fragile X Mental Retardation protein into cytoplasmic granules induces translation repression. Human Molecular Genetics. 11 (24), 3007-3017 (2002).
- Mazroui, R., Huot, M. -. E., Tremblay, S., Boilard, N., Labelle, Y., Khandjian, E. W. Fragile X Mental Retardation protein determinants required for its association with polyribosomal mRNPs. Human Molecular Genetics. 12 (23), 3087-3096 (2003).
- Farny, N. G., Kedersha, N. L., Silver, P. a Metazoan stress granule assembly is mediated by P-eIF2alpha-dependent and -independent mechanisms. RNA. 15 (10), 1814-1821 (2009).
- Gareau, C., Houssin, E., et al. Characterization of fragile x mental retardation protein recruitment and dynamics in Drosophila stress granules. PLoS ONE. 8 (2), (2013).
- Brackett, D. M., Qing, F., Amieux, P. S., Sellers, D. L., Horner, P. J., Morris, D. R. FMR1 transcript isoforms: association with polyribosomes; regional and developmental expression in mouse brain. PLoS ONE. 8 (3), (2013).
- Khandjian, E. W., Huot, M. -. E., Tremblay, S., Davidovic, L., Mazroui, R., Bardoni, B. Biochemical evidence for the association of fragile X mental retardation protein with brain polyribosomal ribonucleoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (36), 13357-13362 (2004).
- Erikson, A., Winblad, B., Wallace, W. Translational control of gene expression in the human brain. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 13 (3-4), 469-479 (1989).
- Stephens, S. B., Nicchitta, C. V In vitro and tissue culture methods for analysis of translation initiation on the endoplasmic reticulum. Methods in Enzymology. 431, 47-60 (2007).
- Koritzinsky, M., Wouters, B. G. Hypoxia and regulation of messenger RNA translation. Methods in Enzymology. 435, 247-273 (2007).
- Khandjian, E. W., Corbin, F., Woerly, S., Rousseau, F. The fragile X mental retardation protein is associated with ribosomes. Nature Genetics. 12, 91-93 (1996).
- Sivan, G., Kedersha, N., Elroy-Stein, O. Ribosomal slowdown mediates translational arrest during cellular division. Molecular and Cellular Biology. 27 (19), 6639-6646 (2007).
- Thomas, J. D., Johannes, G. J. Identification of mRNAs that continue to associate with polysomes during hypoxia. RNA. 13, 1116-1131 (2007).
- Kumaraswamy, S., Chinnaiyan, P., Shankavaram, U. T., Lü, X., Camphausen, K., Tofilon, P. J. Radiation-induced gene translation profiles reveal tumor type and cancer-specific components. Ricerca sul cancro. 68 (10), 3819-3826 (2008).
- Fournier, M. -. J., Coudert, L., et al. Inactivation of the mTORC1-eIF4E Pathway alters Stress Granules Formation. Molecular and Cellular Biology. 33 (11), 2285-2301 (2013).
- Sanchez, G., Dury, A. Y., et al. A novel function for the survival motoneuron protein as a translational regulator. Human Molecular Genetics. 22 (4), 668-684 (2013).
- Béchade, C., Rostaing, P., et al. Subcellular distribution of survival motor neuron (SMN) protein: possible involvement in nucleocytoplasmic and dendritic transport. The European Journal of Neuroscience. 11 (1), 293-304 (1999).
- Goulet, I., Boisvenue, S., Mokas, S., Mazroui, R., Côté, J. TDRD3, a novel Tudor domain-containing protein, localizes to cytoplasmic stress granules. Human Molecular Genetics. 17 (19), 3055-3074 (2008).
- Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. Human let-7a miRNA blocks protein production on actively translating polyribosomes. Nature Structural & Molecular Biology. 13 (12), 1108-1114 (2006).
- Genolet, R., Araud, T., Maillard, L., Jaquier-Gubler, P., Curran, J. An approach to analyse the specific impact of rapamycin on mRNA-ribosome association. BMC Medical Genomics. 1 (33), (2008).
- Del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., Müllner, E. W., Garcia-Sanz, J. a Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments. RNA. 13 (3), 414-421 (2007).
- Thoreen, C. C., Chantranupong, L., Keys, H. R., Wang, T., Gray, N. S., Sabatini, D. M. A unifying model for mTORC1-mediated regulation of mRNA translation. Nature. 485 (7396), 109-113 (2012).
- Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., Mcgeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).
- Morris, D. R. Ribosomal footprints on a transcriptome landscape. Genome Biology. 10 (4), (2009).
