ポリソームプロファイリングによってストレス状態の間に翻訳開始の分析
Summary
ここでは、ストレス条件に応答する真核細胞のmRNA翻訳の開始の変化を分析するための方法を記載している。このメソッドは、非翻訳リボソームからリボソームを翻訳するショ糖勾配に速度の分離に基づいています。
Abstract
mRNA翻訳の正確な制御は、特に、生理学的および病理学的ストレスに応答して、真核細胞の恒常性に必須である。このプログラムの変更は、損傷した細胞の増殖、癌発生の顕著な特徴、または例えば神経変性疾患において見られるような時期尚早の細胞死につながることができる。翻訳調節の分子基盤について知られていることの多くは、密度勾配分画システムを用いてポリソーム分析から得られた。この手法は、線形スクロース勾配上で細胞質抽出物の超遠心分離に依存しています。回転が完了すると、システムは、異なる翻訳に対応し、遠心分離ゾーンの分画および定量化は、このようにポリソームプロファイルをもたらす、リボソーム集団を可能にする。ポリソームプロフィールの変化は、ストレスの種々のタイプに応答して生じる翻訳開始の変化や欠陥の指標である。この技術は、目を評価することができ電子翻訳開始の特定のタンパク質の役割、および特定のmRNAの翻訳活性を測定する。ここでは、正常または応力のいずれかの培養条件で、真核細胞および組織の翻訳開始を評価するために、ポリソームプロファイルを実行するために我々のプロトコルが記載されている。
Introduction
真核細胞は、常に迅速な適応細胞応答を必要とする有害な生理学的および環境ストレス条件の範囲に遭遇する。細胞ストレス応答は、抗生存と生存促進作用性因子との間の正確なバランスを必要とする。このバランスを崩壊させることは、癌や神経変性疾患などのヒトの病理の発展をリードする不可逆的な結果をもたらす可能性がある。ストレス反応の第一段階の間、細胞は、mRNAの翻訳のレベルでの遺伝子発現の変化の協調制御を伴う生存促進経路を活性化する。
真核生物のmRNAの翻訳は、翻訳開始因子（EIFS）、特異的なRNA結合タンパク質（のRBD）と、RNA分子の1との間の協調的な相互作用を伴う複雑な細胞プロセスである。開始、伸長、および終結：mRNA翻訳、3つの異なるフェーズに分割される。すべての3つのフェーズがレギュレーションの対象となりますがlatory機構は、翻訳制御メカニズムは、主にこのようにしてタンパク質合成2の律速段階を構成する翻訳の開始位相を、標的とする。
翻訳開始は 、 私は開始前複合体の形成につながる、三元複合体と40Sリボソームサブユニットへのその後の結合に会った eIF2a.GTP.Met-tRNAの形成に始まる高度に秩序プロセスです。次のステップは、そのようなeIF4F複合eIF3と、翻訳開始因子の活性が関与するmRNAに前開始複合体の動員である。このように形成された48S開始前複合体は、開始コドンAUGを認識するまで、mRNAの5 '非翻訳領域のスキャンを開始するには、この機械を有効に特定の立体構造変化を受ける。翻訳開始因子の多くは、その後解放され、60Sサブユニットが翻訳のために、複雑な有能なリボソーム80Sを形成するために動員され、Aトンその時点でタンパク質合成を開始する（ 図1）。一染色体は、いわゆるポリソーム（またはポリリボソーム）の製造時に同じmRNAを翻訳することができ、複数の80S。ポリソームmRNA上の密度は、開始、伸長および終結率を反映し、したがって、特定の転写物の翻訳可能性の尺度である。しかしながら、ポリソームプロファイルは、主に開始段階におけるmRNA翻訳の変化を評価するために使用される。ここでは、翻訳開始阻害剤としてのプロテアソーム阻害剤を使用している。この薬物による癌細胞の処理は、翻訳開始因子eIF2a をリン酸化し、3 HRIというストレスキナーゼの活性化によって特徴付けストレス応答を誘導する。 eIF2aのリン酸化は、哺乳動物細胞4における翻訳開始の阻害を引き起こす主要なイベントの一つです。
Protocol
Representative Results
Discussion
スクロース勾配上のポリソームプロファイル解析は、細胞または組織から単離したポリソーム9,11-14の濃度を分析することによって、翻訳開始の測定を可能にする。この手法は、 生体内で翻訳開始を測定するのに最適な（ない場合は一意の）アプローチである。これは、細胞周期15の間、細胞を増殖させるの並進状態を監視するために、及び翻訳開始には、ウイルス感?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PAは、ラバル大学の医学部からの奨学金の受取人 "ピエール·デュラン」です。ポリソーム精留塔をRMに自然科学とカナダの工学研究会（MOP-CG095386）によってサポートされていたこの作品は、RMR Mにイノベーション助成金のためのカナダの財団（MOP-GF091050）を通じて取得した新しいCIHR研究者の給与賞を保持している。
私たちは、博士に感謝しています。有益な助言のためのE. Khandjian、I. Gallouzi、S.ジ – マルコとA. Cammas。
Materials
| Cells | ||||
| HeLa cervical cancer cells | American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC) | CCL-2 | ||
| Schneider Drosophila embryonic cells | American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC) | CRL-1963 | ||
| Culture medium and Supplements | ||||
| Schneider’s Drosophila Medium | Sigma-Aldrich | SO146-500ml | ||
| DMEM | Life technologies | 11995-073 | ||
| FBS | Fisher Scientist Scientist | SH30396-03 | ||
| penicillin/streptomycin | Life technologies | 15140122 | ||
| Sucrose solutions | ||||
| D-Sucrose | Fisher Scientist | BP220-212 | ||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 49767 | ||
| Blue Bromophenol | Fisher Scientist | B3925 | ||
| Lysis buffer | ||||
| Tris Hydrochloride | Fisher Scientist | BP153-500 | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670-100G | ||
| NaCl | Tekniscience | 3624-05 | ||
| DTT | Sigma-Aldrich | D 9779 | ||
| Nonidet P40 (Igepal CA-630 ) | MJS Biolynx | 19628 | ||
| SDS | Tekniscience | 4095-02 | ||
| RNase inhibitor (RnaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor) | Life technologies | 10777-019 | ||
| Antiproteases (complete, mini, EDTA free) | Roche | 11,836,170,001 | ||
| RNA Extraction | ||||
| Proteinase K | Life technologies | AM2542 | ||
| Phenol: Chloroforme | Fisher Scientist | BP1754I-400 | ||
| Chloroforme | Fisher Scientist | C298-500 | ||
| Glycogen | Life technologies | 10814-010 | ||
| Isopropanol | Acros organics | 327270010 | ||
| Antibodies | ||||
| anti-FMRP antibody | Fournier et al., Cancer Cell International, 2010 | |||
| anti-Ribosomal Protein L28 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-50362 | ||
| Others | ||||
| Proteasome inhibitor : Bortezomib | LC Laboratories | B-1408 | ||
| DEPC (Diethylpyrocarbonate) | Sigma-Aldrich | D5758-25ml | ||
| RNaseZAP Solution | Life technologies | AM9780 | ||
| Materials | ||||
| T25 cell culture flask | Corning | 430639 | ||
| 1cc U100 Insulin Syringe 28 G1/2 | Fisher Scientist | 148291B | ||
| Tube ultra-centrifugation, PA, 12ml | Fisher Scientist | FSSP9763205 | ||
| Isco Model 160 gradient former | Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA | |||
| Ultracentrifuge Sorvall OTD Combi | ||||
| Thermo Scientific Sorvall Rotor TH-641 | Thermo scientific | 54295 | ||
| Automated Density Fractionation System | Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA | 67-9000-177 | ||
| Isco UA-6 UV-vis detector | Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA | |||
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo scientific | |||
| Ultracentrifuge C 5415 | Eppendorf | |||
| Optical Microscope | Olympus CK2 | |||
Riferimenti
- Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (10), 827-835 (2004).
- Jackson, R. J., Hellen, C. U. T., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (2), 113-127 (2010).
- Fournier, M. -. J., Gareau, C., Mazroui, R. The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules. Cancer Cell International. 10 (12), (2010).
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 6 (4), 318-327 (2005).
- Mazroui, R., Huot, M. -. E., Tremblay, S., Filion, C., Labelle, Y., Khandjian, E. W. Trapping of messenger RNA by Fragile X Mental Retardation protein into cytoplasmic granules induces translation repression. Human Molecular Genetics. 11 (24), 3007-3017 (2002).
- Mazroui, R., Huot, M. -. E., Tremblay, S., Boilard, N., Labelle, Y., Khandjian, E. W. Fragile X Mental Retardation protein determinants required for its association with polyribosomal mRNPs. Human Molecular Genetics. 12 (23), 3087-3096 (2003).
- Farny, N. G., Kedersha, N. L., Silver, P. a Metazoan stress granule assembly is mediated by P-eIF2alpha-dependent and -independent mechanisms. RNA. 15 (10), 1814-1821 (2009).
- Gareau, C., Houssin, E., et al. Characterization of fragile x mental retardation protein recruitment and dynamics in Drosophila stress granules. PLoS ONE. 8 (2), (2013).
- Brackett, D. M., Qing, F., Amieux, P. S., Sellers, D. L., Horner, P. J., Morris, D. R. FMR1 transcript isoforms: association with polyribosomes; regional and developmental expression in mouse brain. PLoS ONE. 8 (3), (2013).
- Khandjian, E. W., Huot, M. -. E., Tremblay, S., Davidovic, L., Mazroui, R., Bardoni, B. Biochemical evidence for the association of fragile X mental retardation protein with brain polyribosomal ribonucleoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (36), 13357-13362 (2004).
- Erikson, A., Winblad, B., Wallace, W. Translational control of gene expression in the human brain. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 13 (3-4), 469-479 (1989).
- Stephens, S. B., Nicchitta, C. V In vitro and tissue culture methods for analysis of translation initiation on the endoplasmic reticulum. Methods in Enzymology. 431, 47-60 (2007).
- Koritzinsky, M., Wouters, B. G. Hypoxia and regulation of messenger RNA translation. Methods in Enzymology. 435, 247-273 (2007).
- Khandjian, E. W., Corbin, F., Woerly, S., Rousseau, F. The fragile X mental retardation protein is associated with ribosomes. Nature Genetics. 12, 91-93 (1996).
- Sivan, G., Kedersha, N., Elroy-Stein, O. Ribosomal slowdown mediates translational arrest during cellular division. Molecular and Cellular Biology. 27 (19), 6639-6646 (2007).
- Thomas, J. D., Johannes, G. J. Identification of mRNAs that continue to associate with polysomes during hypoxia. RNA. 13, 1116-1131 (2007).
- Kumaraswamy, S., Chinnaiyan, P., Shankavaram, U. T., Lü, X., Camphausen, K., Tofilon, P. J. Radiation-induced gene translation profiles reveal tumor type and cancer-specific components. Ricerca sul cancro. 68 (10), 3819-3826 (2008).
- Fournier, M. -. J., Coudert, L., et al. Inactivation of the mTORC1-eIF4E Pathway alters Stress Granules Formation. Molecular and Cellular Biology. 33 (11), 2285-2301 (2013).
- Sanchez, G., Dury, A. Y., et al. A novel function for the survival motoneuron protein as a translational regulator. Human Molecular Genetics. 22 (4), 668-684 (2013).
- Béchade, C., Rostaing, P., et al. Subcellular distribution of survival motor neuron (SMN) protein: possible involvement in nucleocytoplasmic and dendritic transport. The European Journal of Neuroscience. 11 (1), 293-304 (1999).
- Goulet, I., Boisvenue, S., Mokas, S., Mazroui, R., Côté, J. TDRD3, a novel Tudor domain-containing protein, localizes to cytoplasmic stress granules. Human Molecular Genetics. 17 (19), 3055-3074 (2008).
- Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. Human let-7a miRNA blocks protein production on actively translating polyribosomes. Nature Structural & Molecular Biology. 13 (12), 1108-1114 (2006).
- Genolet, R., Araud, T., Maillard, L., Jaquier-Gubler, P., Curran, J. An approach to analyse the specific impact of rapamycin on mRNA-ribosome association. BMC Medical Genomics. 1 (33), (2008).
- Del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., Müllner, E. W., Garcia-Sanz, J. a Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments. RNA. 13 (3), 414-421 (2007).
- Thoreen, C. C., Chantranupong, L., Keys, H. R., Wang, T., Gray, N. S., Sabatini, D. M. A unifying model for mTORC1-mediated regulation of mRNA translation. Nature. 485 (7396), 109-113 (2012).
- Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., Mcgeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).
- Morris, D. R. Ribosomal footprints on a transcriptome landscape. Genome Biology. 10 (4), (2009).
