Анализ инициации трансляции во время стресса кондиций полисом профилирования
Summary
Здесь мы опишем метод для анализа изменений в инициации мРНК перевода эукариотических клеток в ответ на стресс условия. Этот метод основан на разделении скорости на градиентах сахарозы на перевод рибосом из не-переводные рибосом.
Abstract
Точный контроль трансляции мРНК имеет основополагающее значение для эукариотической гомеостаза клеток, особенно в ответ на физиологической и патологической стресса. Изменения этой программы может привести к росту поврежденных клеток, отличительной чертой развития рака, или к преждевременной смерти клеток, таких как видно на нейродегенеративных заболеваний. Многое из того, что известно о молекулярную основу для поступательного контроля была получена из полисом анализа с использованием градиентной системы фракционирования плотности. Этот метод основан на ультрацентрифугирования цитоплазматических экстрактов на линейном градиенте сахарозы. После того, как спин завершена, система позволяет фракционирование и количественное определение центрифугировали зон, соответствующих различным перевод рибосом популяции, в результате чего профиль полисом. Изменения в профиле полисом свидетельствуют о изменениях или дефектов в инициации трансляции, которые происходят в ответ на различные виды стресса. Этот метод также позволяет оценить тыс.е роль специфических белков на инициации трансляции, а также измерять поступательное активность специфических мРНК. Здесь мы опишем наш протокол для выполнения профили полисом для оценки инициацию трансляции эукариотических клеток и тканей под либо нормальных или стрессовых условиях роста.
Introduction
Эукариотические клетки постоянно встречаемся ряд вредных физиологических и экологических условиях стресса, которые требуют быстрого реагирования адаптивного клеток. Реакция на стресс сотовый включает в себя точный баланс между анти-выживания и про-выживания действующих факторов. Разрушение этого баланса может иметь необратимые последствия, ведущие развитие человеческих патологий, таких как рак и нейродегенеративные заболевания. Во время первой стадии реакции на стресс, клетки активируют пути про-выживания, которые включают скоординированное управление изменениями в экспрессии генов на уровне трансляции мРНК.
перевод мРНК у эукариот является сложным клеточный процесс, который включает в скоординированных взаимодействия между инициации трансляции факторов (EIFS), специфическая РНК-связывающих белков (RBDS) и молекул РНК 1. перевод мРНК делится на три этапа: инициирование, удлинение и прекращение. Хотя все три фазы могут быть регуlatory механизмы, трансляционные механизмы контроля нацелены в основном на этапе инициирования перевода, который, таким образом, представляет собой ограничивающую скорость стадию синтеза белка 2.
Инициация трансляции является весьма приказал процесс, который начинается с формирования eIF2a.GTP.Met-тРНК я встретил тройной комплекс и его последующее связывание с 40S рибосомы субъединицы, что приводит к образованию комплекса предварительно инициации. Следующим шагом является привлечение в преиниационного комплекса к мРНК, которая включает деятельность инициации трансляции таких факторов, как eIF4F и eIF3. 48S преиниационного комплекс таким образом подвергается конкретные конформационные изменения, которые позволяют эту технику, чтобы начать сканирование 5'-нетранслируемой области мРНК, пока он не признает инициирующий кодон августа Большинство факторов инициации трансляции затем освобожден и 60S субъединицы набираются сформировать 80S рибосом комплекс компетентным для перевода,т, который начинается синтез точка белка (рис. 1). Более одного 80S monosome можно переводить же мРНК в то время, производя так называемые полисомы (или полирибосомы). Плотность полисом на мРНК отражает инициирование, удлинение и прекращение ставки и, следовательно, является мерой переводимости определенного транскрипта. Однако полисом профиль используется в основном для оценки изменений в трансляции мРНК на стадии инициирования. Здесь мы использовали протеасомную ингибитор как ингибитора инициации трансляции. Лечение раковых клеток с этим препаратом вызывает реакцию на стресс, характеризующийся активации стресс-киназы имени HRI который фосфорилирует фактор инициации трансляции eIF2a 3. Фосфорилирование eIF2a является одним из основных событий, приведших к ингибирования инициации трансляции в клетках млекопитающих 4.
Protocol
Representative Results
Discussion
Анализ полисом профиль на градиентах сахарозы позволяет измерять инициации трансляции на основе анализа плотности полисом, выделенных из клеток или тканей 9,11-14. Этот метод является лучшим (если не единственным) подход для измерения инициацию трансляции в естественных условия…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ПА является получателем стипендии "Пьер Дюран" факультет медицины Университета Лаваля. Эта работа была поддержана естественным наукам и инженерным исследовательского совета Канады (СС-CG095386) в РМ полисом фракционатор была приобретена через Канадский фонд инновационного гранта (СС-GF091050) в RMR М проводит новую CIHR награду следователь зарплаты.
Мы благодарны д-ра. Е. Ханджян, И. Gallouzi, С. Ди-Марко и А. Cammas за полезные советы.
Materials
| Cells | ||||
| HeLa cervical cancer cells | American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC) | CCL-2 | ||
| Schneider Drosophila embryonic cells | American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC) | CRL-1963 | ||
| Culture medium and Supplements | ||||
| Schneider’s Drosophila Medium | Sigma-Aldrich | SO146-500ml | ||
| DMEM | Life technologies | 11995-073 | ||
| FBS | Fisher Scientist Scientist | SH30396-03 | ||
| penicillin/streptomycin | Life technologies | 15140122 | ||
| Sucrose solutions | ||||
| D-Sucrose | Fisher Scientist | BP220-212 | ||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 49767 | ||
| Blue Bromophenol | Fisher Scientist | B3925 | ||
| Lysis buffer | ||||
| Tris Hydrochloride | Fisher Scientist | BP153-500 | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670-100G | ||
| NaCl | Tekniscience | 3624-05 | ||
| DTT | Sigma-Aldrich | D 9779 | ||
| Nonidet P40 (Igepal CA-630 ) | MJS Biolynx | 19628 | ||
| SDS | Tekniscience | 4095-02 | ||
| RNase inhibitor (RnaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor) | Life technologies | 10777-019 | ||
| Antiproteases (complete, mini, EDTA free) | Roche | 11,836,170,001 | ||
| RNA Extraction | ||||
| Proteinase K | Life technologies | AM2542 | ||
| Phenol: Chloroforme | Fisher Scientist | BP1754I-400 | ||
| Chloroforme | Fisher Scientist | C298-500 | ||
| Glycogen | Life technologies | 10814-010 | ||
| Isopropanol | Acros organics | 327270010 | ||
| Antibodies | ||||
| anti-FMRP antibody | Fournier et al., Cancer Cell International, 2010 | |||
| anti-Ribosomal Protein L28 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-50362 | ||
| Others | ||||
| Proteasome inhibitor : Bortezomib | LC Laboratories | B-1408 | ||
| DEPC (Diethylpyrocarbonate) | Sigma-Aldrich | D5758-25ml | ||
| RNaseZAP Solution | Life technologies | AM9780 | ||
| Materials | ||||
| T25 cell culture flask | Corning | 430639 | ||
| 1cc U100 Insulin Syringe 28 G1/2 | Fisher Scientist | 148291B | ||
| Tube ultra-centrifugation, PA, 12ml | Fisher Scientist | FSSP9763205 | ||
| Isco Model 160 gradient former | Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA | |||
| Ultracentrifuge Sorvall OTD Combi | ||||
| Thermo Scientific Sorvall Rotor TH-641 | Thermo scientific | 54295 | ||
| Automated Density Fractionation System | Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA | 67-9000-177 | ||
| Isco UA-6 UV-vis detector | Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA | |||
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo scientific | |||
| Ultracentrifuge C 5415 | Eppendorf | |||
| Optical Microscope | Olympus CK2 | |||
Riferimenti
- Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (10), 827-835 (2004).
- Jackson, R. J., Hellen, C. U. T., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (2), 113-127 (2010).
- Fournier, M. -. J., Gareau, C., Mazroui, R. The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules. Cancer Cell International. 10 (12), (2010).
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 6 (4), 318-327 (2005).
- Mazroui, R., Huot, M. -. E., Tremblay, S., Filion, C., Labelle, Y., Khandjian, E. W. Trapping of messenger RNA by Fragile X Mental Retardation protein into cytoplasmic granules induces translation repression. Human Molecular Genetics. 11 (24), 3007-3017 (2002).
- Mazroui, R., Huot, M. -. E., Tremblay, S., Boilard, N., Labelle, Y., Khandjian, E. W. Fragile X Mental Retardation protein determinants required for its association with polyribosomal mRNPs. Human Molecular Genetics. 12 (23), 3087-3096 (2003).
- Farny, N. G., Kedersha, N. L., Silver, P. a Metazoan stress granule assembly is mediated by P-eIF2alpha-dependent and -independent mechanisms. RNA. 15 (10), 1814-1821 (2009).
- Gareau, C., Houssin, E., et al. Characterization of fragile x mental retardation protein recruitment and dynamics in Drosophila stress granules. PLoS ONE. 8 (2), (2013).
- Brackett, D. M., Qing, F., Amieux, P. S., Sellers, D. L., Horner, P. J., Morris, D. R. FMR1 transcript isoforms: association with polyribosomes; regional and developmental expression in mouse brain. PLoS ONE. 8 (3), (2013).
- Khandjian, E. W., Huot, M. -. E., Tremblay, S., Davidovic, L., Mazroui, R., Bardoni, B. Biochemical evidence for the association of fragile X mental retardation protein with brain polyribosomal ribonucleoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (36), 13357-13362 (2004).
- Erikson, A., Winblad, B., Wallace, W. Translational control of gene expression in the human brain. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 13 (3-4), 469-479 (1989).
- Stephens, S. B., Nicchitta, C. V In vitro and tissue culture methods for analysis of translation initiation on the endoplasmic reticulum. Methods in Enzymology. 431, 47-60 (2007).
- Koritzinsky, M., Wouters, B. G. Hypoxia and regulation of messenger RNA translation. Methods in Enzymology. 435, 247-273 (2007).
- Khandjian, E. W., Corbin, F., Woerly, S., Rousseau, F. The fragile X mental retardation protein is associated with ribosomes. Nature Genetics. 12, 91-93 (1996).
- Sivan, G., Kedersha, N., Elroy-Stein, O. Ribosomal slowdown mediates translational arrest during cellular division. Molecular and Cellular Biology. 27 (19), 6639-6646 (2007).
- Thomas, J. D., Johannes, G. J. Identification of mRNAs that continue to associate with polysomes during hypoxia. RNA. 13, 1116-1131 (2007).
- Kumaraswamy, S., Chinnaiyan, P., Shankavaram, U. T., Lü, X., Camphausen, K., Tofilon, P. J. Radiation-induced gene translation profiles reveal tumor type and cancer-specific components. Ricerca sul cancro. 68 (10), 3819-3826 (2008).
- Fournier, M. -. J., Coudert, L., et al. Inactivation of the mTORC1-eIF4E Pathway alters Stress Granules Formation. Molecular and Cellular Biology. 33 (11), 2285-2301 (2013).
- Sanchez, G., Dury, A. Y., et al. A novel function for the survival motoneuron protein as a translational regulator. Human Molecular Genetics. 22 (4), 668-684 (2013).
- Béchade, C., Rostaing, P., et al. Subcellular distribution of survival motor neuron (SMN) protein: possible involvement in nucleocytoplasmic and dendritic transport. The European Journal of Neuroscience. 11 (1), 293-304 (1999).
- Goulet, I., Boisvenue, S., Mokas, S., Mazroui, R., Côté, J. TDRD3, a novel Tudor domain-containing protein, localizes to cytoplasmic stress granules. Human Molecular Genetics. 17 (19), 3055-3074 (2008).
- Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. Human let-7a miRNA blocks protein production on actively translating polyribosomes. Nature Structural & Molecular Biology. 13 (12), 1108-1114 (2006).
- Genolet, R., Araud, T., Maillard, L., Jaquier-Gubler, P., Curran, J. An approach to analyse the specific impact of rapamycin on mRNA-ribosome association. BMC Medical Genomics. 1 (33), (2008).
- Del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., Müllner, E. W., Garcia-Sanz, J. a Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments. RNA. 13 (3), 414-421 (2007).
- Thoreen, C. C., Chantranupong, L., Keys, H. R., Wang, T., Gray, N. S., Sabatini, D. M. A unifying model for mTORC1-mediated regulation of mRNA translation. Nature. 485 (7396), 109-113 (2012).
- Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., Mcgeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).
- Morris, D. R. Ribosomal footprints on a transcriptome landscape. Genome Biology. 10 (4), (2009).
