Aktivering af latente mutationer med adenovirus-Cre i brystkirtler duktalt system resulterer i en klinisk relevant metastatisk brystkræft. Indarbejdelse af en YFP promotor muliggør sporing af distale metastatiske tumorceller. Denne model er nyttig til at studere latent metastase, anti-tumor immunitet og for at udforme nye immunoterapier til behandling af brystkræft.
Brystkræft er en heterogen sygdom, der involverer komplekse cellulære interaktioner mellem udvikle tumor og immunsystemet, til sidst resulterer i eksponentiel tumorvækst og metastase til distale væv og sammenbruddet af anti-tumor immunitet. Mange nyttige dyremodeller findes til at studere brystkræft, men ingen fuldstændig rekapitulere sygdomsprogression, der forekommer i mennesker. For at få en bedre forståelse af de cellulære interaktioner, der resulterer i dannelsen af latent metastaser og nedsat overlevelse, har vi skabt en inducerbar transgene mus model af YFP-udtrykker duktalt karcinom, der udvikler sig efter seksuel modenhed i immun-kompetente mus og drives ved konsekvent, hormonforstyrrende-uafhængig onkogen ekspression. Aktivering af YFP, ablation af p53, og udtryk for en onkogen form af K-ras blev opnået ved levering af et adenovirus, der udtrykker Cre-rekombinase i brystkirtler kanal af kønsmodne, jomfru hunmus. Tumorerbegynder at dukke 6 uger efter indledningen af onkogene begivenheder. Efter tumorer fremgå, at de udvikler langsomt i cirka to uger, inden de begynder at vokse eksponentielt. Efter 7-8 uger efter adenovirus injektion observeres vaskulatur forbinder tumormassen til distale lymfeknuder med eventuel lymphovascular invasion af YFP + tumorceller til de distale axillære lymfeknuder. Infiltrerende leukocytpopulationer svarer til dem, der findes i humane bryst-carcinomer, herunder tilstedeværelsen af αβ og γδ T-celler, makrofager og MDSCs. Denne unikke model vil lette undersøgelsen af cellulære og immunologiske mekanismer involveret i latent metastase og hviletilstand ud over at være anvendelige til at designe hidtil ukendte immunoterapeutiske tiltag til behandling af invasiv brystkræft.
Brystkræft er den hyppigst forekommende malignitet hos kvinder i hele verden 1,2 og den anden hyppigste årsag til cancer-relaterede dødsfald 2. Komplekse genetiske 3,4 histologisk 5, og kliniske fænotyper 6 anvendes til at karakterisere de forskellige undertyper af brystkræft, og som ofte anvendes som et middel til at forudsige overlevelse. Analyse af en stor gruppe af kvinder med brystcancer viste, at de fleste (ca. 80%) af de patienter, der døde recidiverende inden for 10 år efter fjernelse af den primære tumor 7. For et flertal af invasive brystcarcinomaer, er blevet vist lymphovascular invasion at være stærkt korreleret til et dårligt resultat og mere aggressive kliniske sygdomsforløb 8.
På grund af den genetiske og fænotypiske kompleksitet af brystkræft, er der ingen dyremodel, der rekapitulerer hele forløbet af sygdommen. Humane bryst tumorcellelinier har været hyppigtbruges som xenograft eller ortotopisk 9 modeller af kræft invasiv og metastatisk brystkræft i immune mangel mus. Selv informative, optræder disse modeller i fravær af immun pres, og fordi det er et kors art graft, fordrejer virkningerne af hele tumor mikromiljø. Inducerbare genetiske mutationer drevet af brystkirtler specifikke promotorer, såsom murine brysttumorvirus (MMTV) og surt valleprotein (WAP) har bidraget med en enorm mængde af viden om den genetiske natur brystkræft. Imidlertid er vævet specifik ekspression af disse promotorer kompromitteret af deres lydhørhed over for det endokrine system 10-16, hvilket resulterer i variable udtryk af inducerede genetiske mutationer, der ikke afspejler udtryk for onkogener typisk overudtrykt i human brystkræft. For at overvinde endokrine styring af MMTV drevne udtryk for onkogener, Moody genereret en betinget, doxycyclin inducerbare model overekspression Neu i brystet et al.epitel 17. Denne model er nyttig til deinducing Neu efter tumordannelse at studere regression og tilbagefald, men kræver konstant doxycyclin administration for konsekvent, langsigtet onkogen ekspression. En omfattende diskussion af de mange relevante bryst tumor modeller kan findes i revisionen af Vargo-Gogola et al. 10.
Vores mål var at udvikle en musemodel af kræft sporbart bryst på en fuld C57BL / 6 baggrund, at der efter den permanente induktion af mutationsbegivenheder, modeller dannelsen af en spirende tumor i tilstedeværelse af immun pres. Vi introducerede en adenovirus der udtrykker Cre-rekombinase i brystkirtler aftrækskanaler transgene mus, der indeholder floxet alleler af TP53 og en onkogent form af K-ras og YFP. Cre-ekspression ablates TP53, en hyppigt muterede gen i mange brystcancere 18 og inducerer en oncogen allel af K-ras foruden YFP ekspression specifikti mælkekirtlen ductal epitel. Selvom mutationer i K-ras er sjældne i brystkræft, der forekommer i kun 6,5% af brystkræftpatienter 19,20, overekspression af opstrøms kinaser såsom Her2/neu og EGFR resulterer i konstitutiv aktivering af Ras-signalvejen i humane brysttumorer 21-23. Aktivering af Ras-signalvejen i mange bryst tumorcellelinjer er også blevet rapporteret 24,25. Vi vil beskrive indledningen af tumor dannelse og teknikken af intraductal injektion af et adenovirus, der udtrykker Cre-rekombinase i kønsmodne, jomfru hunmus. Denne model af brystkræft udvikler åbenlyse læsioner, der vokser eksponentielt efter ca 8 uger af langsom tumorprogression med lymphovascular invasion og metastasering til armhulen lymfeknude ved 7-8 uger. Fordi disse mus er på en fuld C57BL / 6 baggrund og YFP-udtrykkende tumorceller er sporbare i distale lymfeknuder, denne model giver et relevant redskab til at studere cellular og immunologiske mekanismer latent metastaser, og vil bidrage til at udvikle nye terapeutiske tilgange til behandling af metastatisk cancer ductal brystkræft.
Succesen for denne procedure afhænger af korrekt teknik under intraductal injektioner, som vil være vanskeligt for utrænede eksperimentatorer. Erfarne forskere i vores laboratorium typisk indhente bryst tumorer 79% af de gange, de administrerer adenovirale injektioner. Problemer med injektion kan resultere i betydeligt forsinket, variabel, eller fraværende tumor udvikling. Hvis nålen er indsat for dybt eller et upassende vinkel, kan duktalt kanalen blive savnet. Det er vigtigt at indtaste sutten lidt forbi skråspids nål (ikke mere end 2 mm), for at forhindre indtrængen gennem brystvævet og ind i serøse membraner fra den ventrale legemshulrum. Desuden kan for lavvandet placering af nålen eller injektion af mere end 3 ml virus bundfald resultere i spild af viral prep uden mælkekirtlen og induktion af utilsigtede tumorer. En måde at overvinde disse problemer er at indsætte nålen ind i brystvorten lidt deeper end 3 mm, og langsomt trække sprøjten tilbage op og ud af kanalen, indtil 2 mm fra spidsen af facet. Dette vil sikre, at brystvæv er målrettet stedet for musklen omkring bughulen af mus (figur 1A). Dette vil også strække brystvorten langs kanterne af sprøjten, så at når virussen udstødes ind i kanalen, er der ingen spild og tab af virale bundfald.
Visualisering af injektion er vanskelig og anbefales praksis for dette skridt. Vi har observeret en stigning i succesfulde injektioner følgende praksis, hvilket resulterer i en højere penetrans af tumorudvikling. Fordi denne teknik bruger nonlactating jomfruelige hunner, er det afgørende at fjerne keratin prop, der brystvorten at afsløre den underliggende kanal kanalen. Vi anbefaler, at praktisere dette trin ved at injicere trypanblåt eller et andet sterilt spores farvestof kanalens inderside og forberede hele brystkirtler mounts at bekræfte målretning af duktalt tree. Derudover har andre protokoller beskriver intraductal injektion af reagenser blevet offentliggjort 33,34, som kan være nyttige til at udvikle korrekt teknik. Problemer med viral forberedelse eller infektion i ductale lumen kan også undersøges ved hjælp af en mCherry udtrykker adenovirus. Non-transgene mus kan anvendes til hvert af disse formål, indtil injektionsteknik optimeres.
Selv om enhver brystkirtel kan bruges til at indlede tumorer, har vi opnået de mest konsekvente vækstrater ved at målrette brystkirtel 4 eller 9, som vi mener, er fordi det er lettere at udføre ordentlig injektioner på disse kirtler, hvilket resulterer i en mere effektiv målretning af kanalen. Nærheden til venstre 4 th eller højre 9 th inguinale mælkekirtler til drænende lyskelymfeknuder lymfeknude er også nyttigt at undersøge anti-tumor immunrespons i forskellige tidsmæssige punkter af tumorprogression. For at modellere og spore latent metastaser til distale steder, transgenic mus blev krydset med LSL-EYFP mus. Tumoren skrider frem, vil vaskulatur forbinder tumoren armhulen lymfeknude blive lidt engorged på cirka 5 uger før tumoren begynder at vokse eksponentielt (figur 3A). Til sidst, efter 7-8 uger, vil lymphovascular invasion resultere i tumorvækst i armhulen lymfeknude (figur 3A og 3B). Brug reporter mus og Cre-loxP teknologi, inkorporering af YFP skaber en platform til at spore tumorceller metastaserende til distale steder i hele tumorprogression. Dette kan lette undersøgelser med henblik på at belyse de cellulære og epigenetiske mekanismer, der fremmer latent metastaser. I vores hænder, brysttumor-cellelinier udtrykte cytokeratin-8, mesothelin, østrogen-receptor-α og Her2/neu, bekræfter målretning af duktale epitel. Men alt efter mutationerne inducerede og på grund af vanskeligheder og variabiliteten af injektioner, anbefaler vihistologisk karakterisering af tumorer Når modellen er veletableret i laboratoriet.
Eftersom brystcancer er sådan en dødelig og omsiggribende sygdom 1,2, er det vigtigt at anvende dyremodeller, der nøjagtigt rekapitulere komplekst samspil mellem tumor og vært. Her beskriver vi en fuldt tilbagekrydses C57BL / 6 murin brysttumor. Først ved at inducere tumorer fra native celler, vi tillader tumoren til at udvikle sig naturligt i en fuld immun mikromiljø. Immun mikromiljø i de avancerede mus brysttumorer sammenfatter populationer af αβ og γδ T-celler, myeloide afledte suppressor celler og makrofager almindeligt observerede i human brystkræft (Figur 4). Som vi har offentliggjort tidligere brug af adenovirus-Cre at inducere tumorer i æggestokkene, fandt vi, at den virale injektion havde ubetydelig indvirkning på de tilsvarende tumor infiltrater og tumorprogression 28. Sekund, endokrine uafhængigudtryk for onkogener sikrer, at tumorceller har vedvarende høje niveauer af target genekspression. For det tredje, ved at udnytte latente mutationer, kan vi styre tidspunktet for tumorigenese at præcis tidsmæssig sporing af tumor evolution. Anvendelser af denne model omfatter forskning på tumorens cellebiologi, undersøgelser af faktorer i tumormikromiljøet, anti-tumor immunrespons, og selv effektiviteten evaluering af nye lægemidler. Gennem tilgængeligheden af Cre-loxP-systemet, kan denne teknik bruges som en platform til at undersøge en bred vifte af yderligere mutationer i indledningen og progression af brystkræft. Vi håber, at brugen af denne model vil øge forståelsen af brystkræft biologi og i sidste ende føre til nye lægemidler rettet mod behandling af metastatisk brystkræft.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af NCI Grants RO1CA157664 og RO1CA124515 og en Breast Cancer Alliance award. Vi vil gerne takke Jeffrey Faust, David Ambrose, og Scott Weiss fra Wistar Flowcytometri core facilitet, James Hayden fra Wistar Imaging facilitet, og hele personalet i Wistar Institute Animal Facility for deres uvurderlige teknisk support.
Trp53tm1Brn transgenic mice Krastm4Tyj transgenic mice |
Obtained from NCI mouse models of human cancer consortium | Mice were backcrossed ten times to a full C57BL/6 background | |
B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J Transgenic mice | Jackson labs | 006148 | |
Primers p53loxp/loxp | Integrated DNA Technologies | 5'-AAGGGGTATGAGGGACAAGG-3' 5'-GAAGACAGAAAAGGGGAGGG-3' |
|
Primers LSL-K-ras G12D/+ | Integrated DNA Technologies | 5'-CGCAGACTGTAGAGCAGCG-3' 5'-CCATGGCTTGAGTAAGTCTGC-3' |
|
Primers for LSL-EYFP to detect Rosa promoter | Integrated DNA Technologies | 5'-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC-3' 5'-GGAGCGGGAGAAATGGATATG-3' 5'-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT-3' |
|
Primers for detection of Mesothelin expression |
Integrated DNA Technologies | 5'-TTGGGTGGATACCACGTCTG-3' 5'-CGGAGTGTAATGTTCTTCTGTC-3' |
|
Primers for detection of Progesterone Receptor expression |
Integrated DNA Technologies | 5'-GCAATGGAAGGGCAGCATAA-3' 5'-TGGCGGGACCAGTTGAATTT-3' |
|
Primers for detection of Cytokeratin 8 expression |
Integrated DNA Technologies | 5'-ATCAGCTCTTCCAGCTTTTCCC-3' 5'-GAAGCGCACCTTGTCAATGAAGG-3' |
|
Primers for detection of Erbb2 expression |
Integrated DNA Technologies | 5'-ACCTGCCCCTACAACTACCT-3' 5'-AAATGCCAGGCTCCCAAAGA-3' |
|
Primers for detection of Estrogen Receptor A expression |
Integrated DNA Technologies | 5'-ATGAAAGGCGGCATACGGAA-3' 5'-GCGGTTCAGCATCCAACAAG-3' |
|
Primers for detection of Estrogen Receptor B expression |
Integrated DNA Technologies | 5'-ACCCAATGTGCTAGTGAGCC-3' 5'-TGAGGACCTGTCCAGAACGA-3' |
|
Primers for detection of B-Actin expression |
Integrated DNA Technologies | 5'-GCCTTCCTTCTTGGGTATGG-3' 5'-CAGCTCAGTAACAGTCCGCC-3' |
|
Adenovirus-CRE | Gene Transfer Vector Core from the University of Iowa | Ad5CMVCre | Store aliquots of virus (4 x 108 pfu/aliquot) at -80C to avoid repeated freeze thaw cycles |
Adenovirus-mCherry | Gene Transfer Vector Core from the University of Iowa | Ad5CMVmCherry | Store aliquots of virus (4 x 108 pfu/aliquot) at -80C to avoid repeated freeze thaw cycles |
Hamilton syringe | Hamilton company | 701RN | 10ml syringe, RN series Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol. |
Custom needle | Hamilton company | 7803-05 | 33 gauge 0.5 inch long RN needle, with a 12 degree bevel. Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol. |
Surgical forceps | Dumont | 52100-58 | Dumostar No5 forceps. Clean with 75% ethanol after each use, followed by autoclaving |
MEM powder | Cellgro | 50 012 PB | Store at 4C in powder and reconstituted form |
Sodium Bicarbonate | Fisher | S233 | Add to MEM and filter stearilize |
Calcium Chloride | Sigma | C4901 | Minimum 96%, anhydrous |