Initiation Metastasierende Mammakarzinom durch Targeting des duktalen Epithel mit Adenovirus-Cre: Eine neue transgene Maus-Modell der Brustkrebs

Summary

Activation of latent mutations with adenovirus-Cre into the mammary ductal system results in a clinically relevant metastatic breast cancer. Incorporation of a YFP promoter allows tracking of distal metastatic tumor cells. This model is useful to study latent metastasis, anti-tumor immunity, and for designing novel immunotherapies to treat breast cancer.

Abstract

Brustkrebs ist eine heterogene Erkrankung, die komplexen zellulären Interaktionen zwischen der Entwicklungs Tumor und Immunsystems, was schließlich in der exponentiellen Tumorwachstum und Metastasen in Geweben distalen und dem Zusammenbruch der Anti-Tumor-Immunität. Viele nützliche Tiermodelle existieren, um Brustkrebs zu studieren, aber keine, die das Fortschreiten der Krankheit beim Menschen auftritt vollständig rekapitulieren. Um ein besseres Verständnis der zellulären Interaktionen, die in der Bildung von latenten Metastasierung und verminderter Überleben zu gewinnen, haben wir einen induzierbaren transgenen Mausmodell von YFP-exprimierenden duktales Karzinom, die nach der Geschlechtsreife entwickelt in immunkompetenten Mäusen und wird angetrieben wird durch konsequente, endokrine unabhängige Onkogenexpression. Die Aktivierung von YFP, Ablation von p53, und Ausdruck einer onkogenen Form von K-ras wurde von der Lieferung eines Adenovirus Cre-Rekombinase in der Milchkanal von sexuell reifen, rein weiblichen Mäusen erreicht. Tumorenbeginnen zu 6 Wochen nach der Initiierung der onkogenen Ereignisse angezeigt. Nach Tumoren deutlich wird, Fortschritte sie sich langsam für etwa zwei Wochen, bevor sie, exponentiell zu wachsen beginnen. Nach 7-8 Wochen nach der Adenovirus-Injektion wird Gefäßsystem beobachtet Anschluss der Tumormasse zu distalen Lymphknoten, mit eventuellen lymphovascular Invasion von YFP + Tumorzellen mit den distalen axillären Lymphknoten. Infiltrierenden Leukozyten-Populationen sind ähnlich zu denjenigen in der menschlichen Brustkarzinome, einschließlich der Anwesenheit von αβ und γδ T-Zellen, Makrophagen und MDSCs gefunden. Dieses einzigartige Modell wird die Untersuchung der zellulären und immunologischen Mechanismen in latenter Metastasen und Ruhe zusätzlich zu nützlich für die Entwicklung neuer immun invasive Interventionen zur Behandlung von Brustkrebs beteiligt sind, erleichtern.

Introduction

Brustkrebs ist die am häufigsten auftretende Krebserkrankung bei Frauen in der ganzen Welt ^1,2 und die zweithäufigste Ursache der durch Krebs verursachten Todesfälle ^2. Komplexe genetische ^{3,4, 5} histologische und klinische Phänotypen ⁶ werden verwendet, um die verschiedenen Subtypen von Brustkrebs zu charakterisieren und werden oft als ein Mittel, um das Überleben vorherzusagen. Die Analyse einer großen Kohorte von Frauen mit Brustkrebs zeigte, dass die meisten (ca. 80%) der Patienten, die starben innerhalb von 10 yr Beitrag Entfernung des Primärtumors ⁷ wiedergekehrt war. Für die Mehrheit der invasiven Mammakarzinome hat lymphovascular Invasion gezeigt worden, um stark zu einem schlechten Ergebnis und aggressiveren klinischen Verlauf der Erkrankung korreliert werden ^8.

Aufgrund der genetischen und phänotypischen Komplexität von Brustkrebs, gibt es keine Tiermodell, das den gesamten Verlauf der Krankheit rekapituliert. Menschliche Muttertumorzelllinien wurden mehrals Xenotransplantat oder orthotopen ⁹ Modelle von invasiven und metastatischen Brustkrebs bei immungeschwächten Mäusen verwendet. Obwohl informative treten diese Modelle in Abwesenheit von Immun Druck und weil es eine Quer Arten Transplantat, verzerren die Wirkung des gesamten Tumor-Mikroumgebung. Induzierbare genetische Mutationen durch Brust spezifische Promotoren, wie Maus-Mammatumorvirus (MMTV) und Molke saures Protein (WAP) angetrieben haben eine enorme Menge an Wissen über die genetische Beschaffenheit von Brustkrebs beigetragen. Jedoch ist die gewebespezifische Expression dieser Promotoren durch ihre Reaktionsfähigkeit mit dem endokrinen System ^10-16 beeinträchtigt, was zu einer variablen Expression der induzierten genetischen Mutationen, spiegeln nicht die Expression von Onkogenen in der Regel in menschlichem Brustkrebs überexprimiert. Um endokrine Kontrolle des MMTV gesteuerte Expression von Onkogenen zu überwinden, Moody et al. Erzeugt eine bedingte, Doxycyclin induzierbaren Überexpression Modell Neu in der BrustEpithel ^17. Dieses Modell ist nützlich für deinducing Neu nach Tumorbildung zu Regression und Wiederholung zu studieren, aber erfordert ständige Doxycyclin Verwaltung für konsistente, langfristige Onkogenexpression. Eine umfassende Diskussion der vielen relevanten Brusttumor-Modelle in der Übersicht von Vargo-Gogola et al. ¹⁰ gefunden werden

Unser Ziel war es, ein Mausmodell für Brustkrebs rückführbar auf Voll C57BL / 6 Hintergrund zu entwickeln, dass nach der ständigen Induktion der Mutationsereignisse, Modelle die Bildung einer entstehenden Tumor in der Anwesenheit von Immundruck. Wir führten ein Adenovirus Cre-Rekombinase in die Milchgänge von transgenen Mäusen enthält floxed Allele Tp53 und eine onkogene Form von K-ras und YFP. Cre-Expression Tp53 abträgt, eine häufig mutierte Gen in vielen Brustkrebs ¹⁸ und induziert eine onkogene Allel des K-ras neben YFP Ausdruck spezifischin der Brust duktalen Epithel. Obwohl Mutationen in K-ras sind selten bei Brustkrebs, in nur 6,5% der Brustkrebspatientinnen ^19,20 auftritt, die Überexpression von stromaufwärtigen Kinasen wie Her2/neu und EGFR bewirken die konstitutive Aktivierung des Ras-Signalwegs in menschlichen Brusttumoren ^21-23. Aktivierung des Ras-Signalwegs in vielen Brusttumorzelllinien wurde auch berichtet, ^24,25. Wir werden den Beginn der Tumorbildung und die Technik der intraduktale Injektion eines Adenovirus Cre-Rekombinase in sexuell reifen, Jungfrau weiblichen Mäusen zu beschreiben. Dieses Modell von Brustkrebs entwickelt offene Läsionen, die exponentiell nach etwa 8 Wochen der langsamen Tumorprogression zu wachsen, mit lymphovascular Invasion und Metastasierung in die axillären Lymphknoten von 7-8 Wochen. Da diese Mäuse sind auf Voll C57BL / 6 Hintergrund und YFP-exprimierenden Tumorzellen sind rückführbar in distalen Lymphknoten, bietet dieses Modell eine entsprechende Werkzeug, um die ce studierenllular und immunologischen Mechanismen der Metastasierung latent und wird dazu beitragen, neue therapeutische Ansätze für die Behandlung von metastasierendem duktalen Brustkrebs zu entwickeln.

Protocol

Alle Tierversuche wurden von der Wistar-Institut Animal Care und Verwenden Committee genehmigt. 1. Erstellung und Wartung von transgenen Mäusen Rasse LSL-K-ras tm4Tyj 26 und Trp53 tm1Brn 27 (von NGI-Maus-Modellen der menschlichen Krebs Konsortium auf eine gemischte Hintergrund erhalten wird) zu einem vollen C57BL / 6 Hintergrund 28 durch Rückkreuzung mindestens 10 Generationen mit C57BL / 6 Mäusen. So verfolgen Tumormetastasen, Rasse B6.129X1-Gt (ROSA) 26Sor tm1 (EYFP) Cos / J (LSL-EYFP, von The Jackson Laboratory auf Voll C57BL / 6 Hintergrund erhalten) mit Doppel transgenen LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / loxP Mäusen. Hinweis: Transgene LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / loxP Mäuse haben loxP-Stellen flankieren eine transkriptionell Schweigen Allel des onkogenen K-ras und der endogenen p53-Locus, so dass bei Cre-vermittelte Exzision, die Überexpression eines onkogenen K-ras Mutante und Ablation von p53 ist achiEVED. Hinweis: Die LSL-EYFP Maus enthält ein Stopcodon flankieren, ein Gen für eine verstärkte gelb fluoreszierendes Protein (YFP), das nach Cre-vermittelter Exzision Ergebnisse der Expression von YFP in den Geweben, in denen die YFP Stop-Kassette wird herausgeschnitten. Rasse transgenen Mäusen zu LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / loxP Mäusen oder LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / loxP LSL-EYFP-Mäuse für intraduktale Injektionen erhalten. Hinweis: Die Mäuse werden als homozygot für p53 loxP / loxP und heterozygot für rassigen LSL-K-ras G12D / +, da Mäuse mit einer homozygote Deletion des K-ras sterben in utero. Verwenden naiv jungfräulichen Weibchen mindestens sechs Wochen alt für intraduktale Injektionen. Hinweis: Die Primer für die Genotypisierung floxed p53 Allel homozygot sind p53 – T010-fwd (5'-AAGGGGTATGAGGGACAAGG-3 ') und p53-T011-rev (5'-GAAGACAGAAAAGGGGAGGG-3'). Sie produzieren eine Wildtyp-Allel bei 391 bp und das p53-Allel floxed bei 461 bp 29,30. Hinweis: Die Primer, die mutierte Form des K-ras detektieren oIMR8273 (5'-CGCAGACTGTAGAGCAGCG-3 ') und oIMR8274 (5'-CCATGGCTTGAGTAAGTCTGC-3'). Sie produzieren das mutierte Bande bei 600 bp detektiert. Hinweis: Für die Dreifach-Reporter YFP transgenen Mäusen, um die Primer die ROSA Kassette erkennen (5'-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC-3 '), die das Wildtyp-Allel (5'-GGAGCGGGAGAAATGGATATG-3') und eine gemeinsame Allel (5'-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT -3 ') führen zur Verstärkung der Banden bei 320 bp für floxed Allel und 600 bp für das Wildtyp-Allel. 2. OP-Vorbereitung Saubere chirurgischen Materialien mit 75% EtOH und Autoklaven sie vor und nach den Injektionen. Führen Operation auf einem Labortisch ordentlich sauber desinfiziert in einem Zimmer in einer Tieranlage. Wischen Sie alle Oberflächen, einschließlich der Bühne und Zifferblätter des Operationsmikroskops mit einem Breitspektrum-Desinfektionslösung, gefolgt von 75% EtOH. Wiegen und Mäuse anästhesiert durch intraperitoneale Injektion einer Mischung aus Ketamin (80-100 mg / kg) und Xylazin (8-10 mg / kg) in steriler Kochsalzlösung. Sanft legen Mäuse wieder in ihre Käfige für 5 Minuten ungestört, während sie unter Narkose zu gehen. Während dieser Zeit erzeugen Virus Niederschläge (siehe Protokoll Nr. 3). Überprüfen Sie, ob Mangel an Reaktion auf Schmerzen, die durch Quetschung Zehe. Die Augen der narkotisierten Mäusen vorsichtig Abdeckung mit Tier Salbe, um übermäßige Hornhaut Austrocknen zu verhindern. Um Unterkühlung zu vermeiden, legen narkotisierten Mäusen auf einem Heizkissen auf kleiner Flamme während des chirurgischen Eingriffs eingestellt und bis sie sich zu erholen beginnen. Für die Behandlung von Schmerzen, verwalten Mäusen subkutan Meloxicam bei 1 mg / kg vor der Operation und 24 Stunden nach. 3. Erzeugung von Virus Niederschläge VORSICHT: Adenovirus-Vektoren, wenn sie modifiziert worden sind und sich nicht replizieren, besteht das Risiko,Infektion. Griff Adenovirus mit Vorsicht. Alle Mitarbeiter sollten entsprechend den Richtlinien des Instituts für den Umgang mit BSL2 Agenten Nach intraduktale Injektion, entsorgen Adenovirus nach BSL2 Richtlinien geschult werden. Speicher Adenovirus konzentrierte Virusbestände bei -80 ° C in Aliquots von 4 x 10 8 pfu jedes ausreichend gefroren zum Einspritzen 16 Tiere mit 3 ml 2,5 x 10 7 pfu des Adenovirus-Partikel. Bewahren Adenovirus aliquoten auf Trockeneis, bis ca. 15-20 min vor Beginn der Injektionen. Hinweis: Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen als Virus-Titer sinkt deutlich zwischen jedem Zyklus. Hinweis: Adenovirus Niederschläge werden durch Modifizieren eines zuvor beschriebenen Protokolls 31 gebildet. Rekonstituieren 504 mg Pulver MEM mit 50 ml steriler Molekular Grad Wasser, Nahrungsergänzungsmittel mit 244 mg Natriumbicarbonat und Filter in sterilen Bedingungen und bei 4 ° C <li> Bereiten Sie die Calciumchlorid-Lösung durch Zugabe von 1,5 g Calciumchlorid in 50 ml molekular reines Wasser und Filter unter sterilen Bedingungen und bei 4 ° C Mischen Aliquots mit 4 x 10 8 pfu Adenovirus-Cre mit ausreichender 3% Saccharose in sterilem Wasser auf ein Endvolumen von 10 ml gelöst. In 34 ml MEM, um das Virus und vorsichtig mischen. Dann fügen Sie 4 ml der CaCl 2-Lösung, vorsichtig mischen, und bei Raumtemperatur für 15-20 min. Shop Adenovirus auf Trockeneis bis bereit, um Niederschläge zu bilden. Vermeiden Auftauen des Adenovirus und Speichern auf Eis oder bei Raumtemperatur für längere Zeiträume, sofern Niederschläge gebildet werden. Anmerkung: Es ist auch möglich, die Saccharose, MEM und CaCl 2 vor den Operationen mischen, wenn es nicht möglich ist, den Adenovirus-Aliquot aufgetaut und beginnen, fällt unmittelbar nach dem Entfernen von -80 ° C. Dieses Aliquot von Saccharose, MEM, und Kalzium kann auf Trockeneis, bis bereit, den Adenovirus hinzufügen gespeichert werden. Hinweis: Viruspartikel werden etwa 1 h stabil. Vor jeder Injektion, sanft Flick das Rohr, um sicherzustellen, Viruspartikel werden gemischt. Zeichnen bis 3 ml (2,5 x 10 7 pfu) von Viruspartikeln in den 10-ml-Spritze und bereiten Sie die Maus für die intraduktale Injektion. 4. Intraduktale Injektion von Viruspartikeln Sanft statt mit der Maus auf dem Rücken auf den beleuchteten Bühne von einem sauberen Dissektionsmikroskop. Beleuchten Sie die Bauchseite mit einer zusätzlichen Lichtquelle und suchen Sie die links oder rechts, 4. 9. Leistenbrustdrüse durch die kleinen weißen Flecken von Pelz (sichtbar auf C57BL / 6 Frauen) jeden Nippel umgibt. Reiben Sie die Brustwarze vorsichtig mit einer sterilen Ethanol getränkten Wattestäbchen, um Haare aus der Brustwarze zu löschen und die Injektionsstelle zu sterilisieren. Wenn sie schwer zu finden sind, vorsichtig eine dicke Schicht einer Enthaarungscreme oder Verwendung Schere, um die Brustwarzen freizulegen. </li> Entfernen Sie das Keratin Stecker, eine Schicht aus dichtem abgestorbene Hautzellen, die Abdeckung wird die Brustwarze. Sobald die Nippel ausgesetzt ist, sollte das Keratin Stecker gut sichtbar unter der Dissektionsmikroskop sein. Sichern Sie die Brustwarze mit feinen chirurgischen Pinzette und ziehen Sie mit wenig Kraft um das Keratin Stecker entfernen. Stabilisieren Sie die Brustwarze zwischen der Zange. Setzen Sie vorsichtig die Nadel zwischen den Zangen, Kanülieren den Kanal Kanal bei 90 °. Geben Sie die Sauger etwas hinter der Abschrägung der Nadel (nicht mehr als 2 mm), um das Eindringen durch das Brustgewebe und in die serösen Membranen der ventralen Körperhöhle zu verhindern. Sie die Nadel zu tief einführen. Um die richtige Tiefe der Injektion zu gewährleisten, ziehen Sie die Nadel bis nach dem Einlegen in das Lumen des Kanals, zeichnen die Brustwarze bis an den Rändern der Nadel, wie es oben gezogen. Hinweis: Visualisierung der Injektion schwierig, deshalb practicE für diesen Schritt wird unter Verwendung von Trypanblau empfohlen. Wenn die Nadel in geeigneter Weise in der Brustkanal platziert, lassen Sie die 3 ml Virus Niederschläge (2,5 x 10 7 pfu des Adenovirus-Cre), indem Sie vorsichtig stürzen die Spritze mit dem Daumen der Hand hält die Spritze. Die Brustwarze sollte etwas aufblasen, wenn die Flüssigkeit aufgenommen ist. 5. Wiederherstellung von Mäusen Platzieren Sie die Maus wieder auf das Heizkissen nach der Injektion, bis sie beginnt, sich von der Narkose zu erholen. Sobald die Maus gewonnen, setzen Sie ihn wieder in einen sauberen Käfig und Monitor für vollständige Erholung und Bewegung. 24 Stunden nach der Injektion intraductal, subkutan verabreichen Meloxicam bei 1 mg / kg. 6. Überwachung Tumorprogression Tasten Sie die Brustdrüse injiziert am Tag 30 für die Erweiterung und Schwellungen. Überwachung der Tumorprogression alle 5-7 Tage einmal geschwollen und vergrößerte Brust Gland beobachtet. Messen Tumorvolumina alle 3-4 Tage für das Tumorwachstum Kinetik einmal tastbaren Tumoren erscheinen (ca. 50-60 Tage nach der Adenovirus-Injektion). Euthanize Mäusen als Tumorvolumen 10% des Körpergewichts der Mäuse überschreiten.

Representative Results

Successful targeting of the mammary ductal tree can be visualized by preparing whole mounts of the mammary gland as previously described32 after injection of trypan blue (to verify proper injection technique (Figure 1A) or an adenovirus expressing mCherry (to verify proper viral preparation and infection of ductal epithelial cells, Figure 1B). Figure 1. Intraductal targeting of mammary glands by injection with trypan blue or adenovirus-mCherry. A) A whole mount, as previously reported32, of the mammary gland after injection of mammary gland #4 with trypan blue was prepared 3 hr post injection to visualize/confirm targeting of the entire ductal tree. Images are 4X magnification. B) Infection of the ductal epithelium with adenovirus by injecting 2.5 x 107 pfu of adenovirus expressing mCherry. Mice were injected intraductally, and 4 days post-injection, a whole mount of the mammary gland was prepared to confirm viral infection of the ductal tree. Image is 4X magnification. MG is mammary gland, LD is the lactiferous, or main duct, and TD is the terminal duct. Click here to view larger image. When tumors are induced in p53loxP/loxP LSL-K-rasG12D/+ transgenic mice, tumors will not be apparent until around day 40 when the mammary glands will become enlarged and swollen. It is necessary to begin palpations when this is observed, monitoring tumor growth every 5-7 days. In our hands, hardening of the mammary gland always precedes the onset of tumor development. Tumors will progress slowly for an additional 2 weeks. Beginning around day 56, tumors will begin to grow exponentially (Figure 2B). At this point, it is critical to measure tumor volumes every 3 days if kinetic studies are desired because there will be slight mouse to mouse variability in tumor progression, which is normal (Figures 2A and 3A). Large abdominal masses will be apparent by day 80 (Figure 2A, 2B, and 3A), after which mice should be euthanized if tumors exceed more than 10% of their body weight. cDNA analysis of three clones from a tumor-bearing mouse revealed expression of mesothelin, cytokeratin-8, Her2/neu, and estrogen receptor-α (Figure 2C). Figure 2. Tumor development in p53loxP/loxP LSL-K-rasG12D/+ mice injected intraductally with adenovirus-Cre. A) Two examples of tumors 80 days after injection with adenovirus expressing Cre. Mice were given 2.5 x 107 PFU of adenovirus expressing Cre and 80 days post tumor-initiation, large palpable masses can be visualized protruding from the abdominal side of the animal. B) Typical tumor kinetics and palpation schedule for tumors induced in p53loxP/loxP LSL-K-rasG12D/+ mice. C) Characterization of three tumor cell clones derived from the same homogenized tumor of a p53loxP/loxP LSL-K-rasG12D/+ mouse. RNA was extracted and cDNA synthesized for RT-PCR analysis using primers specific to β-actin, mesothelin, cytokeratin-8, Her2/neu, progesterone receptor, estrogen receptor-α, and estrogen receptor-β. Click here to view larger image. Similar to the cellular microenvironment in human breast cancer, we have observed infiltration of αβ and γδ T cells as well as myeloid derived suppressor cells and macrophages into the tumors (Figure 4). Vasculature draining to the axillary lymph node will begin to engorge before tumors have grown to encompass the entire mammary tissue where the injection was performed (Figure 3A). Lymphovascular invasion and metastasis of tumor cells can be tracked by crossing LSL-K-rasG12D/+ p53loxP/loxP mice with LSL-EYFP mice. After Cre-mediated excision, tumor cells expressing YFP (both high and low) are detected in the tumor and can be traced metastasizing to the draining axillary lymph node (Figure 3B). Metastasis to the distal axillary lymph node was confirmed by successfully culturing a tumor cell line from this site in a tumor-bearing LSL-K-rasG12D/+ p53loxP/loxP mouse (data not shown). Figure 3. Formation of tumors and latent metastasis to the axillary lymph node. A) Example of three advanced breast tumors with different rates of tumor progression. A solid mass, indicated by the arrowhead, forms and eventually grows to the size of the entire abdominal mammary tissue. The tumor stays confined to the mammary tissue and is not observed to invade or attach to the muscle covering the peritoneal cavity. There is evident engorgement of the superficial epigastric vein between the inguinal and axillary lymph nodes, denoted by white arrowheads. After 7-8 weeks, the axillary lymph node begins to become enlarged due to lymphovascular invasion of the tumor cells, indicated by arrow. B) Metastasis of YFP positive tumor cells can be visualized in the axillary lymph node by flow cytometry. LSL-K-rasG12D/+ p53loxP/loxP LSL-EYFP mice were used to induce tumors and activation of YFP by intraductal delivery of adenovirus-Cre. To verify lymphovascular invasion of tumor cells into the axillary lymph node, 80 days post adenoviral injection, the indicated lymph nodes and organs were harvested and stained for lymphocyte markers and examined for YFP expression. CL represents contralateral nontumor draining lymph node. Results represent gating on CD45 negative tumor cells, indicating the tumor cells are invading the distal axillary lymph node. Numbers represent percent YFP positive cells from total population. Click here to view larger image. Figure 4. Immune infiltrates in mouse transgenic breast tumors. Mouse breast tumors were homogenized and stained for CD45, CD3, γδTCR, CD11b and GR1. Numbers represent percent of positive leukocytes in entire tumor (63.5), total CD3+ (46.7), total CD3 negative (40.1), total CD3+ γδ+ (γδ T cells, 13), CD3+ γδnegative (24), total GR1 high CD11b (MDSC, 28.6) and total CD11b GR1 low (macrophages, 18.5). Click here to view larger image. Due to the anatomy of the mouse and technique of intraductal injections, we find targeting of mammary glands 4 and 9 (Figure 5) yields the most consistent results and reliable injections. However, any gland can be targeted depending upon the preference of the technician performing the surgery. Figure 5. Numbering of mammary ducts. Mammary ducts 4 and 9 are highlighted in red on the diagram and indicated with arrows on the mouse. In our hands, we found that injections were easiest to perform on these mammary ducts, however all other mammary tissues that we targeted developed tumors with similar kinetics. Click here to view larger image.

Discussion

The success of this procedure hinges on proper technique during intraductal injections, which will be difficult for untrained experimenters. Experienced researchers in our laboratory typically obtain breast tumor masses 79% of the times they administer adenoviral injections. Problems with the injection can result in significantly delayed, variable, or absent tumor development. If the needle is inserted too deep or at an inappropriate angle, the ductal canal may be missed. It is important to enter the nipple slightly past the bevel of the needle (not more than 2 mm), to prevent penetration through the mammary tissue and into the serous membranes of the ventral body cavity. Also, too shallow placement of the needle or the injection of greater than 3 ml of virus precipitates can result in spillage of viral prep outside the mammary gland and the induction of unintentional tumors. One way to overcome these issues is to insert the needle into the nipple slightly deeper than 3 mm, and slowly draw the syringe back up out of the duct until 2 mm from the tip of the bevel. This will ensure that mammary tissue is targeted instead of the muscle surrounding the peritoneal cavity of mice (Figure 1A). This will also stretch the nipple along the edges of the syringe so that when the virus is expelled into the duct, there is no spillage and loss of viral precipitates.

Visualization of the injection is difficult and practice for this step is recommended. We have observed an increase in successful injections following practice, resulting in a higher penetrance of tumor development. Because this technique uses nonlactating virgin females, it is critical to remove the keratin plug covering the nipple to reveal the underlying duct canal. We recommend practicing this step by injecting trypan blue or some other sterile traceable dye inside of the duct and preparing whole mammary mounts to confirm targeting of the ductal tree. Additionally, other protocols describing intraductal injection of reagents have been published^33,34, which may be useful for developing proper technique. Issues with viral preparation or infection of the ductal lumen can also be investigated by using a mCherry expressing adenovirus. Nontransgenic mice can be used for each of these purposes until the injection technique is optimized.

Although any mammary gland can be used to initiate tumors, we have achieved the most consistent growth rates by targeting mammary gland 4 or 9, which we believe is because it is easier to perform proper injections on these glands, resulting in more efficient targeting of the duct. The proximity of the left 4^th or right 9^th inguinal mammary glands to the draining inguinal lymph node is also useful to examine anti-tumor immune responses during different temporal points of tumor progression. To model and track latent metastasis to distal sites, transgenic mice were crossed with LSL-EYFP mice. As the tumor progresses, vasculature connecting the tumor to the axillary lymph node will become slightly engorged at approximately 5 weeks, before the tumor begins to grow exponentially (Figure 3A). Eventually, after 7-8 weeks, lymphovascular invasion will result in tumor growth within the axillary lymph node (Figures 3A and 3B). Using reporter mice and Cre-loxP technology, incorporation of YFP creates a platform to track tumor cells metastasizing to distal sites throughout tumor progression. This can facilitate studies aimed at elucidating the cellular and epigenetic mechanisms that promote latent metastasis. In our hands, breast tumor cell lines expressed cytokeratin-8, mesothelin, estrogen receptor-α, and Her2/neu, confirming targeting of the ductal epithelium. However, depending upon the mutations induced and due to the difficulty and the variability of injections, we recommend histological characterization of tumors once the model is well established in the laboratory.

Because breast cancer is such a deadly and pervasive disease^1,2, it is important to use animal models that accurately recapitulate the complex interplay between tumor and host. Here we describe a fully backcrossed C57BL/6 murine model of breast tumor. First, by inducing tumors from native cells, we allow the tumor to evolve naturally in a full immune microenvironment. The immune microenvironment in the advanced mouse breast tumors recapitulates the populations of αβ and γδ T cells, myeloid derived suppressor cells, and macrophages commonly observed in human breast cancer (Figure 4). As we have published previously using adenovirus-Cre to induce ovarian tumors, we found that the viral injection had negligible effect on the corresponding tumor infiltrates and tumor progression²⁸. Second, endocrine independent expression of oncogenes ensures that tumor cells have persistently high levels of target gene expression. Third, by taking advantage of latent mutations, we can control the timing of tumorigenesis to facilitate precise temporal tracking of tumor evolution. Applications of this model include research on tumor cell biology, studies on factors in the tumor microenvironment, anti-tumor immune responses, and even efficacy evaluation of new therapeutics. Through the availability of the Cre-loxP system, this technique can be used as a platform for investigating a diverse array of additional mutations in the initiation and progression of breast tumors. We hope that the use of this model will enhance the understanding of breast cancer biology and eventually lead to new therapeutics aimed at treating metastatic breast cancer.

Materials

Trp53tm1Brn transgenic mice Krastm4Tyj transgenic mice	Obtained from NCI mouse models of human cancer consortium		Mice were backcrossed ten times to a full C57BL/6 background
B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J Transgenic mice	Jackson labs	006148
Primers p53loxp/loxp	Integrated DNA Technologies		5'-AAGGGGTATGAGGGACAAGG-3' 5'-GAAGACAGAAAAGGGGAGGG-3'
Primers LSL-K-ras G12D/+	Integrated DNA Technologies		5'-CGCAGACTGTAGAGCAGCG-3' 5'-CCATGGCTTGAGTAAGTCTGC-3'
Primers for LSL-EYFP to detect Rosa promoter	Integrated DNA Technologies		5'-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC-3' 5'-GGAGCGGGAGAAATGGATATG-3' 5'-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT-3'
Primers for detection of Mesothelin expression	Integrated DNA Technologies		5'-TTGGGTGGATACCACGTCTG-3' 5'-CGGAGTGTAATGTTCTTCTGTC-3'
Primers for detection of Progesterone Receptor expression	Integrated DNA Technologies		5'-GCAATGGAAGGGCAGCATAA-3' 5'-TGGCGGGACCAGTTGAATTT-3'
Primers for detection of Cytokeratin 8 expression	Integrated DNA Technologies		5'-ATCAGCTCTTCCAGCTTTTCCC-3' 5'-GAAGCGCACCTTGTCAATGAAGG-3'
Primers for detection of Erbb2 expression	Integrated DNA Technologies		5'-ACCTGCCCCTACAACTACCT-3' 5'-AAATGCCAGGCTCCCAAAGA-3'
Primers for detection of Estrogen Receptor A expression	Integrated DNA Technologies		5'-ATGAAAGGCGGCATACGGAA-3' 5'-GCGGTTCAGCATCCAACAAG-3'
Primers for detection of Estrogen Receptor B expression	Integrated DNA Technologies		5'-ACCCAATGTGCTAGTGAGCC-3' 5'-TGAGGACCTGTCCAGAACGA-3'
Primers for detection of B-Actin expression	Integrated DNA Technologies		5'-GCCTTCCTTCTTGGGTATGG-3' 5'-CAGCTCAGTAACAGTCCGCC-3'
Adenovirus-CRE	Gene Transfer Vector Core from the University of Iowa	Ad5CMVCre	Store aliquots of virus (4 x 108 pfu/aliquot) at -80C to avoid repeated freeze thaw cycles
Adenovirus-mCherry	Gene Transfer Vector Core from the University of Iowa	Ad5CMVmCherry	Store aliquots of virus (4 x 108 pfu/aliquot) at -80C to avoid repeated freeze thaw cycles
Hamilton syringe	Hamilton company	701RN	10ml syringe, RN series Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol.
Custom needle	Hamilton company	7803-05	33 gauge 0.5 inch long RN needle, with a 12 degree bevel. Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol.
Surgical forceps	Dumont	52100-58	Dumostar No5 forceps. Clean with 75% ethanol after each use, followed by autoclaving
MEM powder	Cellgro	50 012 PB	Store at 4C in powder and reconstituted form
Sodium Bicarbonate	Fisher	S233	Add to MEM and filter stearilize
Calcium Chloride	Sigma	C4901	Minimum 96%, anhydrous