एक नैदानिक प्रासंगिक metastatic स्तन कैंसर में स्तन वाहिनीपरक प्रणाली परिणामों में adenovirus-Cre साथ अव्यक्त परिवर्तन के सक्रियण. एक YFP प्रमोटर के समावेश बाहर का metastatic ट्यूमर कोशिकाओं की ट्रैकिंग की अनुमति देता है. इस मॉडल अव्यक्त मेटास्टेसिस, विरोधी ट्यूमर प्रतिरक्षा, और स्तन कैंसर के इलाज के लिए उपन्यास immunotherapies डिजाइन करने के लिए अध्ययन करने के लिए उपयोगी है.
स्तन कैंसर के अंत में बाहर का ऊतकों और विरोधी ट्यूमर प्रतिरक्षा के पतन के लिए घातीय ट्यूमर के विकास और मेटास्टेसिस, जिसके परिणामस्वरूप विकासशील ट्यूमर और प्रतिरक्षा प्रणाली के बीच जटिल सेलुलर बातचीत से जुड़े एक विषम रोग है. कई उपयोगी पशु मॉडल स्तन कैंसर के अध्ययन के लिए मौजूद हैं, लेकिन कोई भी पूरी तरह से इंसानों में होता है कि रोग प्रगति पुनरावृत्ति. अव्यक्त मेटास्टेसिस के गठन में परिणाम और अस्तित्व के लिए कम है कि सेलुलर बातचीत का एक बेहतर समझ हासिल करने के लिए, हम प्रतिरक्षा सक्षम चूहों में यौन परिपक्वता के बाद विकसित और संचालित है कि YFP व्यक्त ductal कार्सिनोमा के एक inducible ट्रांसजेनिक माउस मॉडल उत्पन्न किया है संगत, अंत: स्रावी स्वतंत्र ओंकोजीन की अभिव्यक्ति से. YFP, p53 की पृथक के सक्रियण, और कश्मीर रास की एक oncogenic फार्म की अभिव्यक्ति यौन परिपक्व, कुंवारी मादा चूहों की स्तन वाहिनी में Cre-recombinase व्यक्त एक adenovirus के वितरण के द्वारा प्राप्त किया गया था. ट्यूमर6 सप्ताह oncogenic घटनाओं की दीक्षा के बाद आने लगते हैं. ट्यूमर स्पष्ट हो जाने के बाद वे तेजी से बढ़ने लगते हैं, इससे पहले कि वे लगभग दो सप्ताह के लिए धीरे धीरे प्रगति. 7-8 सप्ताह के बाद adenovirus इंजेक्शन के बाद, vasculature बाहर कक्षा लिम्फ नोड्स में YFP + ट्यूमर कोशिकाओं के अंतिम lymphovascular आक्रमण के साथ, बाहर का लिम्फ नोड्स में ट्यूमर जन को जोड़ने मनाया जाता है. घुसपैठ ल्युकोसैट आबादी αβ और γδ टी कोशिकाओं, मैक्रोफेज और MDSCs की उपस्थिति सहित मानव स्तन कार्सिनोमा, में पाए जाने वाले के समान हैं. यह अनूठा मॉडल इनवेसिव स्तन कैंसर के इलाज के लिए उपन्यास immunotherapeutic हस्तक्षेप डिजाइनिंग के लिए उपयोगी होने के अलावा अव्यक्त मेटास्टेसिस और निद्रा में शामिल सेलुलर और प्रतिरक्षा तंत्र के अध्ययन की सुविधा होगी.
स्तन कैंसर दुनिया 1,2 और कैंसर से संबंधित मौतों 2 का दूसरा प्रमुख कारण भर में महिलाओं में सबसे अधिक होने वाली द्रोह है. जटिल आनुवंशिक 3,4, ऊतकीय 5, और नैदानिक phenotypes 6 स्तन कैंसर के विभिन्न उपप्रकार को चिह्नित करने के लिए उपयोग किया जाता है और अक्सर अस्तित्व की भविष्यवाणी करने के लिए एक साधन के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं. स्तन कैंसर के साथ महिलाओं की एक बड़ी पलटन के विश्लेषण से निधन हो गया है कि रोगियों की (लगभग 80%) सबसे प्राथमिक ट्यूमर 7 की 10 साल पद से हटाने के भीतर recurred था कि संकेत दिया. इनवेसिव स्तन कार्सिनोमा के बहुमत के लिए, lymphovascular आक्रमण दृढ़ता से एक गरीब परिणाम और रोग 8 से अधिक आक्रामक नैदानिक पाठ्यक्रम के लिए सहसंबद्ध होना दिखाया गया है.
क्योंकि स्तन कैंसर के आनुवंशिक और प्ररूपी जटिलता के कारण, रोग का पूरा कोर्स स्मरण दिलाता है कि कोई जानवर मॉडल है. मानव स्तन ट्यूमर सेल लाइनों अक्सर किया गया हैxenograft या प्रतिरक्षा कमी चूहों में आक्रामक और metastatic स्तन कैंसर के orthotopic 9 मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया. जानकारीपूर्ण हालांकि यह एक पार प्रजातियों भ्रष्टाचार है, क्योंकि इन मॉडलों पूरे ट्यूमर microenvironment के प्रभाव बिगाड़ना, प्रतिरक्षा दबाव के अभाव में होते हैं और. ऐसे murine स्तन ट्यूमर वायरस (MMTV) और मट्ठा अम्लीय प्रोटीन (वैप) के रूप में स्तन विशिष्ट प्रमोटरों द्वारा संचालित inducible आनुवंशिक उत्परिवर्तन स्तन कैंसर के आनुवंशिक प्रकृति के बारे में ज्ञान का एक जबरदस्त राशि का योगदान दिया है. हालांकि, इन प्रमोटरों के ऊतक विशिष्ट अभिव्यक्ति आम तौर पर मानव स्तन कैंसर में overexpressed ओंकोजीन की अभिव्यक्ति का आईना नहीं है कि प्रेरित आनुवंशिक परिवर्तन के चर अभिव्यक्ति में जिसके परिणामस्वरूप, अंत: स्रावी प्रणाली 10-16 को उनकी जवाबदेही से समझौता किया है. ओंकोजीन की MMTV संचालित अभिव्यक्ति की अंत: स्रावी नियंत्रण पर काबू पाने, मूडी एट अल. स्तन में Neu overexpressing एक सशर्त, डॉक्सीसाइक्लिन inducible मॉडल उत्पन्नउपकला 17. इस मॉडल प्रतिगमन और पुनरावृत्ति अध्ययन करने के लिए ट्यूमर गठन के बाद Neu deinducing के लिए उपयोगी है, लेकिन लगातार, लंबे समय तक ओंकोजीन की अभिव्यक्ति के लिए निरंतर डॉक्सीसाइक्लिन प्रशासन की आवश्यकता है. उपलब्ध कई प्रासंगिक स्तन ट्यूमर मॉडल के व्यापक चर्चा Vargo-Gogola एट अल. 10 द्वारा समीक्षा में पाया जा सकता है
हमारा लक्ष्य एक पूर्ण C57BL 6 / पृष्ठभूमि पर मिल स्तन कैंसर के एक माउस मॉडल विकसित करने के लिए था कि, उत्परिवर्तनीय घटनाओं, मॉडल प्रतिरक्षा दबाव की उपस्थिति में एक नवजात ट्यूमर के गठन की स्थायी प्रेरण के बाद. हम TP53 की floxed alleles, और कश्मीर रास की एक oncogenic फार्म, और YFP युक्त ट्रांसजेनिक चूहों के स्तन नलिकाओं में Cre-recombinase व्यक्त एक adenovirus की शुरुआत की. रचनात्मक अभिव्यक्ति TP53, कई स्तन कैंसर के 18 में एक अक्सर उत्परिवर्तित जीन ablates और विशेष रूप से YFP अभिव्यक्ति के अलावा कश्मीर रास की एक oncogenic एलील लातीस्तन ductal उपकला में. कश्मीर रास में उत्परिवर्तन स्तन कैंसर के रोगियों 19,20 का केवल 6.5% में होने वाली स्तन कैंसर में निराला रहे हैं, इस तरह के मानव स्तन ट्यूमर में रास संकेतन मार्ग का विधान सक्रियण में HER2/neu और EGFR परिणाम के रूप में नदी के ऊपर kinases की overexpression 21-23. कई स्तन ट्यूमर सेल लाइनों में रास संकेतन मार्ग के सक्रियण भी 24,25 सूचित किया गया है. हम ट्यूमर गठन की दीक्षा और यौन परिपक्व, कुंवारी मादा चूहों में Cre-recombinase व्यक्त एक adenovirus की intraductal इंजेक्शन की तकनीक के बारे में बताएगी. स्तन कैंसर के इस मॉडल 7-8 हफ्तों से कक्षा लिम्फ नोड के लिए lymphovascular आक्रमण और मेटास्टेसिस के साथ, धीमी गति से ट्यूमर प्रगति के बारे में 8 सप्ताह के बाद तेजी से बढ़ने कि प्रकट घावों को विकसित करता है. इन चूहों को एक पूर्ण C57BL 6 / पृष्ठभूमि पर हैं और YFP व्यक्त ट्यूमर कोशिकाओं बाहर का लिम्फ नोड्स में मिल रहे हैं, क्योंकि इस मॉडल CE अध्ययन करने के लिए एक प्रासंगिक उपकरण प्रदान करता हैllular और प्रतिरक्षाविज्ञानी अव्यक्त मेटास्टेसिस के तंत्र और metastatic ductal स्तन कैंसर के उपचार के लिए उपन्यास चिकित्सकीय दृष्टिकोण को विकसित करने में मदद मिलेगी.
इस प्रक्रिया की सफलता अप्रशिक्षित प्रयोगकर्ताओं के लिए मुश्किल हो जाएगा, जो intraductal इंजेक्शन के दौरान उचित तकनीक पर टिका है. हमारी प्रयोगशाला में अनुभवी शोधकर्ताओं आम तौर पर स्तन ट्यूमर जनता वे adenoviral इंजेक्शन प्रशासन टाइम्स की 79% प्राप्त करते हैं. इंजेक्शन के साथ कोई समस्या काफी देरी, चर, या अनुपस्थित ट्यूमर के विकास में परिणाम कर सकते हैं. सुई भी गहरी या एक अनुचित कोण पर डाला जाता है, तो वाहिनीपरक नहर याद किया जा सकता है. यह स्तन के ऊतकों के माध्यम से और उदर शरीर गुहा के तरल झिल्ली में प्रवेश को रोकने के लिए, थोड़ा सुई (नहीं तो और अधिक से अधिक 2 मिमी) का उठाव पिछले निप्पल दर्ज करने के लिए महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, वायरस अवक्षेप के एक से अधिक 3 मिलीग्राम की सुई या इंजेक्शन की भी उथले प्लेसमेंट स्तन ग्रंथि और अनजाने में ट्यूमर के शामिल होने के बाहर वायरल प्रस्तुत करने के spillage में परिणाम कर सकते हैं. इन मुद्दों पर काबू पाने के लिए एक तरह से थोड़ा deepe निप्पल में सुई डालने के लिए हैआर 3 मिमी, और धीरे धीरे उठाव की नोक से 2 मिमी तक वापस ऊपर वाहिनी के बाहर सिरिंज आकर्षित से. यह स्तन के ऊतकों के बजाय चूहों की peritoneal गुहा (चित्रा 1 ए) के आसपास के मांसपेशियों का लक्ष्य रखा गया है कि यह सुनिश्चित करेंगे. वायरस वाहिनी में निष्कासित कर दिया है जब, वायरल अवक्षेप का कोई spillage और नुकसान है कि वहाँ तो यह भी सिरिंज के किनारों के साथ निपल खिंचाव जाएगा.
इंजेक्शन के दृश्य के लिए मुश्किल है और इस कदम के लिए अभ्यास की सिफारिश की है. हम ट्यूमर के विकास का एक उच्च penetrance में जिसके परिणामस्वरूप, अभ्यास के बाद सफल इंजेक्शन में वृद्धि देखा है. इस तकनीक कुंवारी महिलाओं nonlactating उपयोग करता है, यह अंतर्निहित वाहिनी नहर प्रकट करने के निप्पल को कवर केरातिन प्लग को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है. हम वाहिनी के अंदर trypan नीले या कुछ अन्य बाँझ मिल डाई इंजेक्शन लगाने और ductal टीआर का लक्ष्य पुष्टि करने के लिए पूरे स्तन mounts तैयारी द्वारा इस कदम का अभ्यास करने की अनुशंसाई. इसके अतिरिक्त, अभिकर्मकों की intraductal इंजेक्शन का वर्णन अन्य प्रोटोकॉल उचित तकनीक के विकास के लिए उपयोगी हो सकता है, जो 33,34 प्रकाशित किया गया है. वाहिनीपरक लुमेन के वायरल तैयारी या संक्रमण के साथ मुद्दे भी एक mCherry व्यक्त adenovirus का उपयोग करके जांच की जा सकती है. इंजेक्शन तकनीक अनुकूलित है जब तक Nontransgenic चूहों इन उद्देश्यों में से प्रत्येक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
किसी भी स्तन ग्रंथि के ट्यूमर आरंभ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, हम हम इसे और अधिक कुशल लक्ष्यीकरण, जिसके परिणामस्वरूप इन ग्रंथियों पर उचित इंजेक्शन प्रदर्शन करने के लिए आसान है क्योंकि मेरा मानना है कि जो स्तन ग्रंथि 4 या 9, लक्षित करके सबसे लगातार विकास दर हासिल की है डक्ट. वाम 4 वें की निकटता या draining वंक्षण लिम्फ नोड के लिए सही 9 वें वंक्षण स्तन ग्रंथियों ट्यूमर प्रगति के विभिन्न अस्थायी अंक के दौरान विरोधी ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए भी उपयोगी है. बाहर का साइटों मॉडल और अव्यक्त मेटास्टेसिस को ट्रैक करने के लिए, टीransgenic चूहों LSL-EYFP चूहों के साथ पार कर रहे थे. ट्यूमर के रूप में प्रगति ट्यूमर तेजी से (चित्रा 3) विकसित करने के लिए शुरू होने से पहले, कक्षा लिम्फ नोड के लिए ट्यूमर को जोड़ने वाहिका संरचना, पर लगभग 5 हफ्तों से थोड़ा engorged हो जाएगा. आखिरकार, 7-8 सप्ताह के बाद, lymphovascular आक्रमण कक्षा लिम्फ नोड (आंकड़े 3 ए और 3 बी) के भीतर ट्यूमर के विकास में परिणाम होगा. संवाददाता चूहों और रचनात्मक-loxP प्रौद्योगिकी का उपयोग करना, YFP के समावेश ट्यूमर प्रगति के दौरान बाहर का साइटों के लिए metastasizing ट्यूमर कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए एक मंच बनाता है. इस अव्यक्त मेटास्टेसिस को बढ़ावा देने कि सेलुलर और epigenetic तंत्र elucidating के उद्देश्य से अध्ययन की सुविधा कर सकते हैं. हमारे हाथ में, स्तन ट्यूमर सेल लाइनों ductal उपकला का लक्ष्य पुष्टि cytokeratin-8, mesothelin, एस्ट्रोजन रिसेप्टर α, और HER2/neu व्यक्त किया. हालांकि, प्रेरित उत्परिवर्तन पर और कारण कठिनाई और इंजेक्शन की परिवर्तनशीलता के लिए निर्भर करता है, हम अनुशंसा करते हैंमॉडल एक बार ट्यूमर के histological लक्षण वर्णन अच्छी तरह से प्रयोगशाला में स्थापित है.
स्तन कैंसर एक ऐसी घातक और व्यापक रोग 1,2 है, इसलिए यह सही ट्यूमर और मेजबान के बीच जटिल परस्पर क्रिया पुनरावृत्ति कि पशु मॉडल का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. यहाँ हम स्तन ट्यूमर की एक पूरी तरह से backcrossed C57BL 6 / murine मॉडल का वर्णन. सबसे पहले, देशी कोशिकाओं से ट्यूमर उत्प्रेरण द्वारा, हम ट्यूमर एक पूर्ण प्रतिरक्षा microenvironment में स्वाभाविक रूप से विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं. उन्नत माउस स्तन ट्यूमर में प्रतिरक्षा microenvironment सामान्यतः (चित्रा 4) मानव स्तन कैंसर में मनाया αβ की आबादी और γδ टी कोशिकाओं, माइलॉयड व्युत्पन्न शमन कोशिकाओं, और मैक्रोफेज स्मरण दिलाता है. हम डिम्बग्रंथि ट्यूमर को उत्पन्न करने के लिए adenovirus-Cre का उपयोग पहले से प्रकाशित किया है, हम वायरल इंजेक्शन इसी ट्यूमर पैठ और ट्यूमर प्रगति 28 पर नगण्य प्रभाव पड़ा मिला. दूसरा, अंत: स्रावी स्वतंत्रओंकोजीन की अभिव्यक्ति ट्यूमर कोशिकाओं लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति की लगातार उच्च स्तर को सुनिश्चित करता है कि. तीसरा, अव्यक्त म्यूटेशन का लाभ लेने से, हम ट्यूमर विकास की सटीक अस्थायी ट्रैकिंग की सुविधा के लिए tumorigenesis के समय को नियंत्रित कर सकते हैं. इस मॉडल के आवेदन ट्यूमर कोशिका जीव विज्ञान पर शोध में शामिल हैं, ट्यूमर microenvironment, विरोधी ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, और नई चिकित्सा विज्ञान की भी प्रभावकारिता मूल्यांकन में कारकों पर पढ़ाई. Cre पर loxP प्रणाली की उपलब्धता के माध्यम से, इस तकनीक में स्तन ट्यूमर की दीक्षा और प्रगति में अतिरिक्त परिवर्तन की एक विविध सरणी की जांच के लिए एक मंच के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. हम इस मॉडल का उपयोग स्तन कैंसर जीव विज्ञान की समझ बढ़ाने और अंततः metastatic स्तन कैंसर के इलाज के उद्देश्य से नई चिकित्सा विज्ञान के लिए नेतृत्व करेंगे.
The authors have nothing to disclose.
इस काम NCI अनुदान RO1CA157664 और RO1CA124515 द्वारा समर्थित है, और एक स्तन कैंसर एलायंस पुरस्कार दिया गया था. हम Wistar फ्लो कोर सुविधा, Wistar इमेजिंग सुविधा से जेम्स हेडन, और उनके अमूल्य तकनीकी समर्थन के लिए Wistar संस्थान जानवरों की सुविधा का पूरा स्टाफ से जेफरी Faust, डेविड एम्ब्रोस, और स्कॉट वीस को धन्यवाद देना चाहूंगा.
Trp53tm1Brn transgenic mice Krastm4Tyj transgenic mice |
Obtained from NCI mouse models of human cancer consortium | Mice were backcrossed ten times to a full C57BL/6 background | |
B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J Transgenic mice | Jackson labs | 006148 | |
Primers p53loxp/loxp | Integrated DNA Technologies | 5'-AAGGGGTATGAGGGACAAGG-3' 5'-GAAGACAGAAAAGGGGAGGG-3' |
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Primers LSL-K-ras G12D/+ | Integrated DNA Technologies | 5'-CGCAGACTGTAGAGCAGCG-3' 5'-CCATGGCTTGAGTAAGTCTGC-3' |
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Primers for LSL-EYFP to detect Rosa promoter | Integrated DNA Technologies | 5'-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC-3' 5'-GGAGCGGGAGAAATGGATATG-3' 5'-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT-3' |
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Primers for detection of Mesothelin expression |
Integrated DNA Technologies | 5'-TTGGGTGGATACCACGTCTG-3' 5'-CGGAGTGTAATGTTCTTCTGTC-3' |
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Primers for detection of Progesterone Receptor expression |
Integrated DNA Technologies | 5'-GCAATGGAAGGGCAGCATAA-3' 5'-TGGCGGGACCAGTTGAATTT-3' |
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Primers for detection of Cytokeratin 8 expression |
Integrated DNA Technologies | 5'-ATCAGCTCTTCCAGCTTTTCCC-3' 5'-GAAGCGCACCTTGTCAATGAAGG-3' |
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Primers for detection of Erbb2 expression |
Integrated DNA Technologies | 5'-ACCTGCCCCTACAACTACCT-3' 5'-AAATGCCAGGCTCCCAAAGA-3' |
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Primers for detection of Estrogen Receptor A expression |
Integrated DNA Technologies | 5'-ATGAAAGGCGGCATACGGAA-3' 5'-GCGGTTCAGCATCCAACAAG-3' |
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Primers for detection of Estrogen Receptor B expression |
Integrated DNA Technologies | 5'-ACCCAATGTGCTAGTGAGCC-3' 5'-TGAGGACCTGTCCAGAACGA-3' |
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Primers for detection of B-Actin expression |
Integrated DNA Technologies | 5'-GCCTTCCTTCTTGGGTATGG-3' 5'-CAGCTCAGTAACAGTCCGCC-3' |
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Adenovirus-CRE | Gene Transfer Vector Core from the University of Iowa | Ad5CMVCre | Store aliquots of virus (4 x 108 pfu/aliquot) at -80C to avoid repeated freeze thaw cycles |
Adenovirus-mCherry | Gene Transfer Vector Core from the University of Iowa | Ad5CMVmCherry | Store aliquots of virus (4 x 108 pfu/aliquot) at -80C to avoid repeated freeze thaw cycles |
Hamilton syringe | Hamilton company | 701RN | 10ml syringe, RN series Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol. |
Custom needle | Hamilton company | 7803-05 | 33 gauge 0.5 inch long RN needle, with a 12 degree bevel. Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol. |
Surgical forceps | Dumont | 52100-58 | Dumostar No5 forceps. Clean with 75% ethanol after each use, followed by autoclaving |
MEM powder | Cellgro | 50 012 PB | Store at 4C in powder and reconstituted form |
Sodium Bicarbonate | Fisher | S233 | Add to MEM and filter stearilize |
Calcium Chloride | Sigma | C4901 | Minimum 96%, anhydrous |