Aktivering av latent mutasjoner med adenovirus-Cre i melke ductal systemet resulterer i en klinisk relevant metastatisk brystkreft. Inkorporering av en YFP promoter tillater sporing av distale metastatiske tumorceller. Denne modellen er nyttig for å studere latent metastase, anti-tumor immunforsvar, og for å utforme nye immunterapi for å behandle brystkreft.
Brystkreft er en heterogen sykdom som involverer kompliserte cellulære interaksjoner mellom utviklings svulst og immunsystem, til slutt resulterer i eksponentiell tumorvekst og metastasering til distale vev og sammenbruddet av anti-tumor immunitet. Mange nyttige dyremodeller eksisterer for å studere brystkreft, men ingen fullstendig rekapitulere sykdomsprogresjon som forekommer hos mennesker. For å få en bedre forståelse av de cellulære interaksjoner som fører til dannelsen av latent metastasering og redusert overlevelse, har vi generert en induserbar transgen musemodell av YFP-uttrykke duktalt karsinom som utvikler seg etter kjønnsmodning i immun-kompetente mus og drives ved konsekvent, endokrine uavhengig onkogen uttrykk. Aktivering av YFP, ablasjon av p53, og ekspresjon av et oncogent form av K-ras ble oppnådd ved levering av en adenovirus som uttrykker Cre-rekombinase inn i melkekanalen av seksuelt modne, jomfrue hunnmus. Svulsterbegynner å vises seks uker etter oppstart av kreftfremkallende hendelser. Etter svulster bli tydelig, fremgang de sakte i ca to uker før de begynner å vokse eksponentielt. Etter 7-8 uker etter adenovirus injeksjon, blir blodkar observert koble tumormassen til distale lymfeknuter, med eventuell lymphovascular invasjonen av YFP + tumorceller til de distale axillaris lymfeknuter. Infiltrere leukocyttpopulasjoner er lik de som finnes i humane brystcarcinomer, inkludert tilstedeværelsen av αβ og γδ T-celler, makrofager og MDSCs. Denne unike modellen vil lette studiet av cellulære og immunologiske mekanismer som er involvert i latent metastase og uvirksom i tillegg til å være nyttige for å utforme nye immunterapeutiske intervensjoner for å behandle invasiv brystkreft.
Brystkreft er den hyppigst forekommende kreftformen hos kvinner over hele verden 1,2 og den nest største årsaken til kreft-relaterte dødsfall to. Kompleks genetisk 3,4, histologiske 5, og kliniske fenotyper 6 blir brukt til å karakterisere de forskjellige subtyper av brystkreft og ofte blir brukt som et middel for å forutsi overlevelse. Analyse av en stor kohort av kvinner med brystkreft indikerte at det meste (ca. 80%) av pasienter som døde hadde dukket opp igjen i løpet av 10 år etter fjerning av den primære tumoren 7.. For et flertall av invasive brystcarsinomer har lymphovascular invasjonen vist seg å være sterkt korrelert til et dårlig resultat og mer aggressiv klinisk sykdomsforløp åtte.
På grunn av den genetiske og fenotypiske kompleksiteten av brystkreft, er det ingen dyremodell som sammenfatter hele sykdomsforløpet. Humane brysttumorcellelinjer som har vært hyppigbrukt som xenograft eller ortotopiske ni modeller av invasiv og metastatisk brystkreft i immunmangelfull mus. Selv informative, disse modellene forekommer i fravær av immun trykk, og fordi det er en kryss arter graft, forvrenge effekten av hele tumoren mikromiljøet. Induserbare genetiske mutasjoner drevet av melke spesifikke arrangører som murine brystkjertelvirus (MMTV) og myse surt protein (WAP) har bidratt med en enorm mengde kunnskap om den genetiske natur brystkreft. Imidlertid er vevsspesifikk ekspresjon av disse promotorer kompromittert av deres respons på det endokrine system 10-16, noe som resulterer i den variable ekspresjon av induserte genetiske mutasjoner som ikke gjenspeiler ekspresjon av onkogener typisk overexpressed i human brystkreft. For å overvinne endokrin kontroll av MMTV drevet uttrykk for onkogener, Moody et al. Generert en betinget, doksycyklin induserbar modell overekspresjon Neu i brystetepitel 17. Denne modellen er nyttig for deinducing Neu etter tumordannelse å studere regresjon og tilbakefall, men krever konstant doksycyklin administrasjon for konsistent, langsiktig onkogen uttrykk. En omfattende diskusjon av de mange relevante brystsvulst modeller tilgjengelig kan finnes i anmeldelsen av Vargo-Gogola et al. 10
Vårt mål var å utvikle en musemodell for sporbar brystkreft på en full C57BL / 6 bakgrunn som, etter den permanente induksjon av mutasjons hendelser, modeller dannelsen av en begynnende svulst i nærvær av immun press. Vi innførte en adenovirus uttrykker Cre-recombinase inn i melkegangene av transgene mus som inneholder floxed alleler av TP53, og et oncogent form av K-ras, og YFP. Cre uttrykk ablates TP53, en hyppig mutert gen i mange brystkrefttilfeller 18 og induserer en onkogene allel av K-ras i tillegg til YFP uttrykk spesifikti melke ductal epitel. Selv om mutasjoner i K-ras er sjeldne i brystkreft, forekommer i bare 6,5% av brystkreftpasienter 19,20, overekspresjon av oppstrøms kinaser som HER2/neu og EGFR resultat i konstituerende aktivering av Ras signalveien i menneskelige brystkreft svulster 21-23. Aktivering av Ras signalveien i mange brysttumorcellelinjer er også blitt rapportert 24,25. Vi vil beskrive oppstart av tumordannelse og teknikken til intraductal injeksjon av en adenovirus uttrykker Cre-recombinase inn kjønnsmodne, jomfrue hunnmus. Denne modellen av brystkreft utvikler utilslørt lesjoner som vokser eksponentielt etter ca 8 uker med treg tumor progresjon, med lymphovascular invasjon og metastasering til aksillær lymfeknute etter 7-8 uker. Fordi disse musene er på en full C57BL / 6 bakgrunn og YFP-uttrykker kreftceller er sporbare i distale lymfeknuter, gir denne modellen et relevant verktøy for å studere cellular og immunologiske mekanismer av latent metastasering og vil bidra til å utvikle nye terapeutiske tilnærminger for behandling av metastatisk brystkreft ductal.
Suksessen til denne prosedyren er avhengig av riktig teknikk under intraductal injeksjoner, noe som vil være vanskelig for utrente forskere. Erfarne forskere i vårt laboratorium vanligvis få bryst tumor masser 79% av tiden de administrerer adenovirale injeksjoner. Problemer med injeksjon kan føre til vesentlige forsinkelser, variabel, eller fraværende tumor utvikling. Hvis nålen er satt inn for dypt eller på en upassende vinkel, kan det ductal kanalen bli savnet. Det er viktig å legge inn nippelen litt forbi skråkanten av nålen (ikke mer enn 2 mm), for å hindre gjennomtrengning gjennom melke vev og inn i de serøse membraner av den ventrale kroppshulen. Dessuten kan for grunt plassering av nålen, eller injeksjon av større enn 3 ml av virusbunnfall medføre søl av viral prep utenfor melkekjertelen, og induksjon av utilsiktede tumorer. En måte å løse disse problemene er å sette nålen inn i brystvorten litt deeper enn 3 mm, og langsomt å trekke sprøyten tilbake opp og ut av kanalen til 2 mm fra spissen av den koniske. Dette vil sikre at brystvevet er rettet i stedet for muskelen som omgir bukhulen til mus (figur 1A). Dette vil også strekke nippelen langs kantene av sprøyten, slik at når viruset er utvist inn i kanalen, er det ingen utslipp og tap av virale bunnfall.
Visualisering av injeksjonen er vanskelig og praksis for dette trinnet er anbefalt. Vi har observert en økning i vellykkede injeksjoner etter praksis, noe som resulterer i en høyere pene av tumorutvikling. Fordi denne teknikken bruker nonlactating jomfrue kvinner, er det viktig å fjerne det keratin pluggen dekker nippelen for å avdekke den underliggende kanal kanalen. Det anbefales å praktisere dette trinnet ved å injisere trypan blå eller et annet sterilt sporbare fargestoff på innsiden av kanalen og forbereder hele mammary monteringer for å bekrefte målretting av ductal tree. I tillegg har andre protokoller som beskriver intraductal injeksjon av reagenser som er publisert 33,34, som kan være nyttig for å utvikle passende teknikk. Problemer med viral forberedelse eller infeksjon i duktale lumen kan også bli undersøkt ved hjelp av en mCherry uttrykke adenovirus. Nontransgenic musene kan anvendes for hvert av disse formål inntil injeksjonsteknikken er optimalisert.
Selv om noen melkekjertlene kan brukes til å initiere svulster, har vi oppnådd de mest konsekvente vekstrater ved å målrette melkekjertlene fire eller ni, som vi tror er fordi det er lettere å utføre riktige injeksjoner på disse kjertlene, noe som resulterer i mer effektiv målretting av kanal. Nærheten til venstre 4. eller høyre 9 th lyskemelkekjertlene til drenering lyske lymfeknute er også nyttig å undersøke anti-tumor immunresponser under ulike time poeng av tumor progresjon. For å modellere og spore latent metastaser til distale områder, transgenic mus ble krysset med LSL-EYFP mus. Ettersom tumor skrider frem, vil vaskulaturen forbinder tumor til armhulen lymfeknute blitt litt engorged på omtrent 5 uker, før tumoren begynner å vokse eksponensielt (figur 3A). Til slutt, etter 7-8 uker, vil lymphovascular invasjon resultere i tumorvekst i aksillære lymfeknute (figurene 3A og 3B). Bruke reporter mus og Cre-loxP teknologi, skaper inkorporering av YFP en plattform for å spore kreftceller metastasizing til distale områder i hele tumor progresjon. Dette kan legge til rette for studier med sikte på å belyse de cellulære og epigenetiske mekanismer som fremmer latent metastasering. I våre hender, bryst tumor cellelinjer uttrykt cytokeratin-8, mesothelin, østrogen reseptor-α, og HER2/neu, bekrefter målretting av duktalt epitel. Imidlertid, avhengig av de mutasjoner som er indusert og på grunn av vanskeligheten og variabiliteten av injeksjoner, anbefalesHistologisk karakterisering av tumorer Når modellen er veletablert i laboratoriet.
Fordi brystkreft er en dødelig og utbredte sykdom 1,2, er det viktig å bruke dyremodeller som nøyaktig rekapitulere det komplekse samspillet mellom tumor og vert. Her beskriver vi et fullt backcrossed C57BL / 6 murine modell av brystsvulst. Først ved å fremkalle svulster fra innfødte celler, tillater vi svulsten til å utvikle seg naturlig i en full immunmikromiljøet. Immunmikromiljøet i de avanserte musebrystsvulster sammenfatter de populasjoner av αβ og γδ T-celler, myeloide avledet suppressor-celler og makrofager som vanligvis observeres i human brystkreft (figur 4). Som vi har publisert tidligere ved hjelp av adenovirus-Cre å indusere ovarietumorer, fant vi at viral injeksjon hadde ubetydelig effekt på de tilsvarende svulst infiltrater og tumorprogresjon 28. For det andre endokrine uavhengigekspresjon av onkogener sikrer at tumorcellene har vedvarende høye nivåer av target genekspresjon. Tredje, ved å dra nytte av latente mutasjoner, kan vi kontrollere tidspunktet for tumorigenesis å lette presis tidsmessige sporing av svulst evolusjon. Anvendelser av denne modellen inkluderer forskning på tumorcellebiologi, studier av faktorer i mikromiljøet tumor, anti-tumor immunrespons, og til og med effekt evaluering av nye terapeutiske midler. Gjennom tilgjengeligheten av Cre-loxP system, kan denne teknikken brukes som en plattform for å undersøke et variert utvalg av tilleggs mutasjoner i initiering og progresjon av brystsvulster. Vi ønsker at bruk av denne modellen vil øke forståelsen av brystkreft biologi og til slutt lede til nye terapeutiske midler som tar sikte på behandling av metastatisk brystkreft.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av NCI Grants RO1CA157664 og RO1CA124515, og en Breast Cancer Alliance award. Vi vil gjerne takke Jeffrey Faust, David Ambrose, og Scott Weiss fra Wistar flowcytometrisystemer kjernefasilitet, James Hayden fra Wistar Imaging anlegget, og hele staben av Wistar Institute Animal Facility for uvurderlig teknisk support.
Trp53tm1Brn transgenic mice Krastm4Tyj transgenic mice |
Obtained from NCI mouse models of human cancer consortium | Mice were backcrossed ten times to a full C57BL/6 background | |
B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J Transgenic mice | Jackson labs | 006148 | |
Primers p53loxp/loxp | Integrated DNA Technologies | 5'-AAGGGGTATGAGGGACAAGG-3' 5'-GAAGACAGAAAAGGGGAGGG-3' |
|
Primers LSL-K-ras G12D/+ | Integrated DNA Technologies | 5'-CGCAGACTGTAGAGCAGCG-3' 5'-CCATGGCTTGAGTAAGTCTGC-3' |
|
Primers for LSL-EYFP to detect Rosa promoter | Integrated DNA Technologies | 5'-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC-3' 5'-GGAGCGGGAGAAATGGATATG-3' 5'-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT-3' |
|
Primers for detection of Mesothelin expression |
Integrated DNA Technologies | 5'-TTGGGTGGATACCACGTCTG-3' 5'-CGGAGTGTAATGTTCTTCTGTC-3' |
|
Primers for detection of Progesterone Receptor expression |
Integrated DNA Technologies | 5'-GCAATGGAAGGGCAGCATAA-3' 5'-TGGCGGGACCAGTTGAATTT-3' |
|
Primers for detection of Cytokeratin 8 expression |
Integrated DNA Technologies | 5'-ATCAGCTCTTCCAGCTTTTCCC-3' 5'-GAAGCGCACCTTGTCAATGAAGG-3' |
|
Primers for detection of Erbb2 expression |
Integrated DNA Technologies | 5'-ACCTGCCCCTACAACTACCT-3' 5'-AAATGCCAGGCTCCCAAAGA-3' |
|
Primers for detection of Estrogen Receptor A expression |
Integrated DNA Technologies | 5'-ATGAAAGGCGGCATACGGAA-3' 5'-GCGGTTCAGCATCCAACAAG-3' |
|
Primers for detection of Estrogen Receptor B expression |
Integrated DNA Technologies | 5'-ACCCAATGTGCTAGTGAGCC-3' 5'-TGAGGACCTGTCCAGAACGA-3' |
|
Primers for detection of B-Actin expression |
Integrated DNA Technologies | 5'-GCCTTCCTTCTTGGGTATGG-3' 5'-CAGCTCAGTAACAGTCCGCC-3' |
|
Adenovirus-CRE | Gene Transfer Vector Core from the University of Iowa | Ad5CMVCre | Store aliquots of virus (4 x 108 pfu/aliquot) at -80C to avoid repeated freeze thaw cycles |
Adenovirus-mCherry | Gene Transfer Vector Core from the University of Iowa | Ad5CMVmCherry | Store aliquots of virus (4 x 108 pfu/aliquot) at -80C to avoid repeated freeze thaw cycles |
Hamilton syringe | Hamilton company | 701RN | 10ml syringe, RN series Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol. |
Custom needle | Hamilton company | 7803-05 | 33 gauge 0.5 inch long RN needle, with a 12 degree bevel. Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol. |
Surgical forceps | Dumont | 52100-58 | Dumostar No5 forceps. Clean with 75% ethanol after each use, followed by autoclaving |
MEM powder | Cellgro | 50 012 PB | Store at 4C in powder and reconstituted form |
Sodium Bicarbonate | Fisher | S233 | Add to MEM and filter stearilize |
Calcium Chloride | Sigma | C4901 | Minimum 96%, anhydrous |