Aktivering av latenta mutationer med adenovirus-Cre i bröst duktal systemet resulterar i en kliniskt relevant metastaserande bröstcancer. Införande av en YFP promotor möjliggör spårning av distala metastaserande tumörceller. Denna modell är användbar för att studera latent metastaser, antitumörimmunitet, och för att utforma nya immunterapier för behandling av bröstcancer.
Bröstcancer är en heterogen sjukdom som involverar komplexa cellulära interaktioner mellan utvecklings tumör-och immunsystemet, så småningom resulterar i exponentiell tumörtillväxt och metastasering till distala vävnader och kollapsen av antitumörimmunitet. Många användbara djurmodeller finns för att studera bröstcancer, men ingen helt rekapitulera sjukdomsförloppet som förekommer hos människor. För att få en bättre förståelse av de cellulära interaktioner som resulterar i bildandet av latent metastaser och minskad överlevnad, har vi genererat en inducerbar transgen musmodell av YFP-uttrycker duktal cancer som utvecklas efter könsmognad i immun-kompetenta möss och drivs genom konsekvent, hormonoberoende onkogen uttryck. Aktivering av YFP, ablation av p53, och uttryck av en onkogen form av K-ras har uppnåtts genom tillhandahållandet av ett adenovirus som uttrycker Cre-rekombinas in i bröstkanal könsmogna, virgin honmöss. Tumörerbörjar dyka 6 veckor efter initiering av onkogena händelser. Efter att tumörer uppstår, utvecklas de långsamt i cirka två veckor innan de börjar växa exponentiellt. Efter 7-8 veckor efter adenovirus injektion, är kärl observeras ansluter tumörmassan till distala lymfkörtlar, med eventuell lymphovascular invasion av YFP + tumörceller till de distala lymfkörtlar. Infiltrerande leukocytpopulationer är liknande dem som finns i humana bröstkarcinom, inklusive närvaron av αβ och γδ T-celler, makrofager och MDSCs. Denna unika modell kommer att underlätta studier av cellulära och immunologiska mekanismer som är involverade i latent metastaser och dvala förutom att vara användbara för att utforma nya immunterapeutiska interventioner för behandling av invasiv bröstcancer.
Bröstcancer är den vanligast förekommande malignitet hos kvinnor över hela världen 1,2 och den näst vanligaste orsaken till cancerrelaterade dödsfall 2. Komplexa genetiska 3,4, histologiska 5, och kliniska fenotyper 6 används för att karakterisera de olika subtyper av bröstcancer och ofta används som ett sätt att förutsäga överlevnad. Analys av en stor kohort av kvinnor med bröstcancer visade att de flesta (ca 80%) av de patienter som dog hade återkommit inom 10 år efter avlägsnande av den primära tumören 7. För en majoritet av invasiva bröstkarcinom har lymphovascular invasion visat sig vara starkt korrelerad till ett dåligt utfall och mer aggressiv klinisk sjukdomsförlopp 8.
På grund av den genetiska och fenotypiska komplexitet bröstcancer, det finns ingen djurmodell som rekapitulerar hela sjukdomsförloppet. Humana brösttumörcellinjer har oftaanvänds som xenograft eller orthotopic 9 modeller av invasiva och metastaserande bröstcancer i immun brist möss. Även informativ, dessa modeller förekommer i frånvaro av immun tryck och eftersom det är en cross art transplantat, snedvrider effekterna av hela tumören mikromiljö. Inducerbara genetiska mutationer som drivs av bröst specifika promotorer såsom murina brösttumörvirus (MMTV) och vassle surt protein (WAP) har bidragit med en enorm mängd kunskap om den genetiska naturen av bröstcancer. Dock är vävnadsspecifikt uttryck av dessa promotorer äventyras genom sin lyhördhet för det endokrina systemet 10-16, vilket resulterar i varierande expression av inducerade mutationer som inte speglar uttrycket av onkogener vanligtvis överuttryckt i human bröstcancer. För att övervinna endokrina kontrollen av MMTV driven uttryck av onkogener, Moody et al. Genererade ett villkorat, doxycyklin inducible modell överuttryck Neu i bröstetepitel 17. Denna modell är användbar för deinducing Neu efter tumörbildning för att studera regression och återkommande, men kräver ständig doxycyklin administration för konsekventa, långsiktiga onkogen uttryck. En omfattande diskussion om de många relevanta brösttumörmodeller som finns återfinns i den översyn av Vargo-Gogola et al. 10
Vårt mål var att utveckla en musmodell av spårbar bröstcancer på en full C57BL / 6 bakgrund som, efter den permanenta induktion av mutationshändelser, modeller bildandet av en begynnande tumör i närvaro av immun tryck. Vi införde ett adenovirus som uttrycker Cre-rekombinas in i bröstkanalerna i transgena möss som innehåller floxed alleler av TP53 och en onkogen form av K-ras och YFP. Cre uttryck ablates TP53, en ofta muterad gen i många bröstcancer 18 och inducerar en onkogen allel av K-ras förutom YFP uttryck specifikti mjölk duktal epitel. Även mutationer i K-ras är ovanliga i bröstcancer, som förekommer i endast 6,5% av bröstcancerpatienter 19,20, överuttryck av uppströms kinaser såsom Her2/neu och EGFR leder till konstitutiv aktivering av Ras-signaleringsvägen i humana brösttumörer 21-23. Aktivering av Ras-signaleringsvägen i många brösttumörcellinjer har också beskrivits 24,25. Vi kommer att beskriva initieringen av tumörbildning och den teknik för intraductal injektion av ett adenovirus som uttrycker Cre-rekombinas in i könsmogna, virgin honmöss. Denna modell av bröstcancer utvecklar uppenbara skador som växer exponentiellt efter ca 8 veckors långsam tumörprogression, med lymphovascular invasion och metastasering till armhålan lymfkörteln med 7-8 veckor. Eftersom dessa möss är på en full C57BL / 6 bakgrund och YFP-uttryckande tumörceller är spårbara i distala lymfkörtlar, ger denna modell ett relevant verktyg för att studera cellular och immunologiska mekanismer för latent metastaser och kommer att bidra till att utveckla nya terapeutiska metoder för behandling av metastaserad duktal bröstcancer.
Framgången för detta förfarande hänger på korrekt teknik under intraductal injektioner, vilket kommer att bli svårt för otränade praktiker. Erfarna forskare i vårt laboratorium får vanligtvis brösttumörmassor 79% av de gånger de administrerar adenovirala injektioner. Problem med injektion kan leda till kraftigt försenad, variabel, eller frånvarande tumörutveckling. Om nålen sätts in för djupt eller vid en olämplig vinkel, kan duktal kanalen missas. Det är viktigt att komma in i bröstvårtan något förbi fasningen på nålen (ej mer än 2 mm), för att förhindra penetrering genom bröstvävnad och in i de serösa membran av den ventrala kroppshåligheten. Dessutom kan för grunt placering av nålen eller injektion av mer än 3 ml virus fällningar leda till spill av viral prep utanför bröstkörteln och induktion av oavsiktliga tumörer. Ett sätt att lösa dessa problem är att sätta nålen i bröstvårtan något deeper än 3 mm, och långsamt dra tillbaka sprutan upp ur kanalen tills 2 mm från spetsen av avfasningen. Detta kommer att säkerställa att bröstvävnad är riktad i stället för den muskel som omger bukhålan hos möss (Figur 1A). Detta kommer också att sträcka nippeln längs kanterna på sprutan så att när viruset drivs ut in i kanalen, det finns inget spill och förlust av virus-fällningar.
Visualisering av injektion är svår och praxis för detta steg är att rekommendera. Vi har observerat en ökning av framgångsrika injektioner efter praktiken, vilket resulterar i en högre penetrans av tumörutveckling. Eftersom denna teknik använder nonlactating jungfru honor, är det viktigt att avlägsna keratin plugg täcker nippeln att avslöja den underliggande kanalen kanalen. Vi rekommenderar att praktisera det här steget genom att injicera trypanblått eller någon annan steril spårbar färg på insidan av kanalen och förbereda hela bröst fästen för att bekräfta inriktning av duktal tree. Dessutom har andra protokoll som beskriver intraductal injektion av reagens publicerad 33,34, som kan vara användbart för att utveckla rätt teknik. Problem med viral beredning eller infektion i duktal lumen kan också undersökas genom att använda en mCherry uttrycker adenovirus. Icke-transgena möss kan användas för vart och ett av dessa syften, tills injektionstekniken optimeras.
Även om någon bröstkörteln kan användas för att initiera tumörer har vi uppnått de mest konsekventa tillväxttakten genom att rikta bröstkörtel 4 eller 9, vilket vi tror beror på att det är lättare att utföra ordentliga injektioner på dessa körtlar, vilket resulterar i en effektivare inriktning av kanalen. Närheten till vänster 4: e eller höger 9: e ljumsk mjölkkörtlar till dränerande inguinal lymfkörteln är också användbart för att undersöka antitumörimmunsvar under olika tidspunkter tumörprogression. För att modellera och spåra latent metastasering till distala platser, transgenic möss korsas med LSL-EYFP möss. Eftersom tumören fortskrider, kommer vaskulatur ansluter tumören till axillär lymfkörtel blivit något svullna hos ca 5 veckor, innan tumören börjar växa exponentiellt (figur 3A). Så småningom, efter 7-8 veckor kommer lymphovascular invasion resultera i tumörtillväxt i den axillära lymfkörtlar (Figur 3A och 3B). Använda reporter möss och Cre-loxP-teknik, inkorporering av YFP skapar en plattform för att spåra tumörceller metastasizing till distala platser i hela tumörprogression. Detta kan underlätta studier för att belysa de cellulära och epigenetiska mekanismer som främjar latent metastaser. I våra händer, brösttumörcellinjer uttryckte cytokeratin-8, mesotelin, östrogenreceptor-α, och Her2/neu bekräftar inriktning av duktal epitel. Emellertid, beroende på mutationer induceras och på grund av svårigheten och variationen i injektioner rekommenderar vihistologisk karakterisering av tumörer När modellen är väl etablerad i laboratoriet.
Eftersom bröstcancer är en så dödlig och genomträngande sjukdom 1,2, är det viktigt att använda djurmodeller som exakt rekapitulera det komplexa samspelet mellan tumör och värd. Här beskriver vi ett fullständigt tillbakakorsade C57BL / 6 mus modell av brösttumör. Först genom att inducera tumörer från naturliga celler, tillåter vi tumören att utvecklas naturligt i en fullständig immunmikromiljö. Immunmikromiljö i de avancerade mus brösttumörer rekapitulerar befolkningarna av αβ och γδ T-celler, myeloid härledda suppressorceller, och makrofager som vanligen observerats i human bröstcancer (Figur 4). Som vi tidigare har publicerat med hjälp av adenovirus-Cre att framkalla äggstockstumörer, fann vi att den virala injektionen hade försumbar effekt på de motsvarande tumör infiltrat och tumörprogression 28. För det andra, endokrina oberoendeuttryck av onkogener gör att tumörcellerna har fortsatt höga nivåer av mål-genuttryck. För det tredje, genom att utnyttja latenta mutationer, kan vi styra tidpunkten för tumörbildning för att underlätta exakt tidsmässig spårning av tumörutvecklingen. Tillämpningar av denna modell inkluderar forskning på tumörcellbiologin, studier av faktorer i tumörmikromiljö, anti-tumör immunsvar, och även effekten utvärdering av nya läkemedel. Genom tillgång till Cre-loxP-systemet, kan denna teknik användas som en plattform för att undersöka en mångfald av ytterligare mutationer i initiering och progression av brösttumörer. Vi hoppas att användningen av denna modell kommer att öka förståelsen för bröstcancer biologi och på sikt leda till nya läkemedel för att behandla metastaserande bröstcancer.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av NCI Grants RO1CA157664 och RO1CA124515, och en bröstcancer Alliance utmärkelsen. Vi vill tacka Jeffrey Faust, David Ambrose, och Scott Weiss från Wistar flödescytometri kärnanläggningen, James Hayden från Wistar Imaging anläggning och hela personalen på djurfaciliteten för deras ovärderliga teknisk support Wistar institutet.
Trp53tm1Brn transgenic mice Krastm4Tyj transgenic mice |
Obtained from NCI mouse models of human cancer consortium | Mice were backcrossed ten times to a full C57BL/6 background | |
B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J Transgenic mice | Jackson labs | 006148 | |
Primers p53loxp/loxp | Integrated DNA Technologies | 5'-AAGGGGTATGAGGGACAAGG-3' 5'-GAAGACAGAAAAGGGGAGGG-3' |
|
Primers LSL-K-ras G12D/+ | Integrated DNA Technologies | 5'-CGCAGACTGTAGAGCAGCG-3' 5'-CCATGGCTTGAGTAAGTCTGC-3' |
|
Primers for LSL-EYFP to detect Rosa promoter | Integrated DNA Technologies | 5'-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC-3' 5'-GGAGCGGGAGAAATGGATATG-3' 5'-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT-3' |
|
Primers for detection of Mesothelin expression |
Integrated DNA Technologies | 5'-TTGGGTGGATACCACGTCTG-3' 5'-CGGAGTGTAATGTTCTTCTGTC-3' |
|
Primers for detection of Progesterone Receptor expression |
Integrated DNA Technologies | 5'-GCAATGGAAGGGCAGCATAA-3' 5'-TGGCGGGACCAGTTGAATTT-3' |
|
Primers for detection of Cytokeratin 8 expression |
Integrated DNA Technologies | 5'-ATCAGCTCTTCCAGCTTTTCCC-3' 5'-GAAGCGCACCTTGTCAATGAAGG-3' |
|
Primers for detection of Erbb2 expression |
Integrated DNA Technologies | 5'-ACCTGCCCCTACAACTACCT-3' 5'-AAATGCCAGGCTCCCAAAGA-3' |
|
Primers for detection of Estrogen Receptor A expression |
Integrated DNA Technologies | 5'-ATGAAAGGCGGCATACGGAA-3' 5'-GCGGTTCAGCATCCAACAAG-3' |
|
Primers for detection of Estrogen Receptor B expression |
Integrated DNA Technologies | 5'-ACCCAATGTGCTAGTGAGCC-3' 5'-TGAGGACCTGTCCAGAACGA-3' |
|
Primers for detection of B-Actin expression |
Integrated DNA Technologies | 5'-GCCTTCCTTCTTGGGTATGG-3' 5'-CAGCTCAGTAACAGTCCGCC-3' |
|
Adenovirus-CRE | Gene Transfer Vector Core from the University of Iowa | Ad5CMVCre | Store aliquots of virus (4 x 108 pfu/aliquot) at -80C to avoid repeated freeze thaw cycles |
Adenovirus-mCherry | Gene Transfer Vector Core from the University of Iowa | Ad5CMVmCherry | Store aliquots of virus (4 x 108 pfu/aliquot) at -80C to avoid repeated freeze thaw cycles |
Hamilton syringe | Hamilton company | 701RN | 10ml syringe, RN series Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol. |
Custom needle | Hamilton company | 7803-05 | 33 gauge 0.5 inch long RN needle, with a 12 degree bevel. Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol. |
Surgical forceps | Dumont | 52100-58 | Dumostar No5 forceps. Clean with 75% ethanol after each use, followed by autoclaving |
MEM powder | Cellgro | 50 012 PB | Store at 4C in powder and reconstituted form |
Sodium Bicarbonate | Fisher | S233 | Add to MEM and filter stearilize |
Calcium Chloride | Sigma | C4901 | Minimum 96%, anhydrous |