定量リアルタイムPCRを用いて脳脊髄液マイクロRNAプロファイリング

Summary

私たちは、脳脊髄液（CSF）中のマイクロRNAをプロファイリングするリアルタイムPCRのプロトコルを記述します。 RNA抽出プロトコールを除いて、手順は他の体液、培養細胞、または組織試料から抽出したRNAに拡張することができる。

Abstract

マイクロRNA（miRNA）は、それらの翻訳抑制を調節することにより、mRNAおよびその結果として、上に位置する部位を標的とするRISCを誘導することにより、遺伝子制御の強力な層を構成している。 miRNA発現の変化は、すべての主要な複雑な疾患の発症に関与することが示されている。さらに、最近の知見は、miRNAが細胞外環境に分泌し、それらが高い安定性で循環することができ、血流および他の体液を入力することができることを示した。このような循環のmiRNAの機能は、主にとらえどころのないままですが、このようなmiRNAプロファイリングアレイのような体系的な高スループットのアプローチは、神経変性疾患や癌のいくつかのタイプを含むいくつかの病的状態におけるmiRNAシグネチャーの同定につながるている。この文脈において、脳脊髄液中のmiRNA発現プロファイルの同定は、我々の最近の研究で報告されたように、バイオマーカー分析のためのmiRNAの魅力的な候補にする。

_content ">このようなマイクロアレイ、定量的リアルタイムPCR（定量PCR）、および深いシーケンシングなどのマイクロRNAのプロファイリングに利用できるいくつかのツールがあります。ここでは、定量的リアルタイムPCRにより脳脊髄液中のマイクロRNAのプロファイルを作成するための感度の高い方法を記載している。私たちは、 Exiqon社のマイクロRNAを使用し、すぐに使用できるPCR法人間のパネルIと742のユニークな人間のマイクロRNAの検出を可能にする二V2.R、我々は、三連の実行で配列を行い、我々は処理され、ジェネックスプロフェッショナル5ソフトウェアを使用してデータを分析した。

このプロトコルを使用して、我々は成功した細胞株および初代細胞の様々な種類のマイクロRNA、CSF、血漿、およびホルマリン固定パラフィン包埋組織をプロファイルしています。

Introduction

マイクロRNAは、転写後に遺伝子発現を調節する非コードRNA（長さ21〜23ヌクレオチド）の小さなファミリーに属する。マイクロRNAは、比較的安定であると思われる細胞外空間に分泌させることができる。 miRNAの発現の変化を決定するmiRNAプロファイルを行い、大量のデータを処理する、バイオマーカーの同定に向けた重要なステップであることができるが威圧されてもよい。

ここでは、敏感なリアルタイムPCRによって（他の体液に適用）脳脊髄液におけるmiRNA発現の変化を決定するためのプロトコルを記載している。また、統計分析および結果のグラフ表示を含む、データ分析のためのソフトウェアの使用を記載している。全体の手順は、比較的容易かつ簡単であり、プロファイリングおよびリアルタイムPCRマシンの数が利用可能な、比較的迅速されるサンプルの数に応じ。実験の部は、取り扱いの精度が要求さ384ウェルプレートへピペッティングRNA、ジェネックスを用いてデータ解析部インフォマティクスと統計の一部の基本的な知識を必要とする。

Protocol

次のプロトコルは、準備ができてPCRプレートを使用して、CSF、プロファイルマイクロRNAからRNAを単離するための標準的な手順を説明します。有機相抽出は、任意であり、キャリアRNAがRNAの最大の回収を確実に抽出の間、試料に添加されていることに注意してください。これにより、RNAを定量化する必要はない。 cDNAは、前日（約2時間）を合成した場合、全体的な6-8のプ?…

Representative Results

この研究からの結果は、以前に公開されている1。geNormアプリケーションを使用して、候補参照マイクロRNAの解析から1の結果を示す図 。したがって、2つのマイクロRNAは、miR-622及びmiR-1266は、参照遺伝子として同定されたおよびmiRNA値を正規化するために使用した。 CSFの研究のために、我々は、サンプルの三つのグループを有していた…

Discussion

マイクロRNAは、翻訳を阻害および/ ​​またはmRNA分解^2を促進することにより、遺伝子発現を調節する小さな非コードRNAである。による無細胞条件で​​の高い安定性のために、マイクロRNAは、多くの体液中で検出されている。さらに、マイクロRNAの別個の発現プロフィールがヒトの癌^3-9の様々な段階および/ ​​または進行と相関している。

古典チップ?…

Materials

Table III. List of equipment

Equipment	Company	Catalog Number
Finnpipette Novus Multichannel Pipetter	Thermo Scientific	HH05279
Finntip Pipette Tips	Thermo Scientific	9400613
Thermal Cycler C1000	Biorad
0.2 ml Low Profile, Clear PCR tubes	Biorad	TLS0801
Flat Cap Strips	Biorad	TLS0803
LightCycler® 480 Real-Time PCR System	Roche
LightCycler® 480 Sealing Foil	Roche	04 729 757 001
Refrigerated Centrifuge 5804R	Eppendorf
Swing-bucket Rotor, 4-place	Eppendorf	A-4-44
Bench-Top Mini Centrifuge	Fisher	05-090-100
Bench-Top Vortex	Fisher
1.5 ml Microcentrifuge Tubes, Sterilized	Fisher	02-681-5
Matrix Reagent Reservoir, 25 ml	Thermo Scientific	8093
Thermomixer Confort	Eppendorf
Bench-To Mini Centrifuge Sigma 1-15	Sigma
Bench-Top Vortex	Velp Scientifica	F202A0173

Table IV. List of reagents

Reagents	Company	Catalog Number
Universal c-DNA synthesis kit, 16-32 rxns	Exiqon	203300
SYBR Green master mix, Universal RT, 25 ml	Exiqon	203400
Ultrapure Distilled Water Dnase, Rnase free	Invitrogen	10977-015
MicroRNA Ready to use PCR Human Panels (I+II) V2.R	Exiqon	203608
mirVana™ miRNA isolation Kit, 40 isolations	Ambion	AM1556
MS2 RNA carrier	Roche Applied Science	10165948001
2Betamercaptoethanol 98%	Sigma Aldrich	M3148-25ml
Ethanol 100%	Carlo Erba	64-17-5
Nuclease free water	Qiagen	1039480
RNAse Zap®	Ambion	AM9780