Flydende dyrket Streptomyces kulturer er kendetegnet ved myceliske pellets, der er heterogene i størrelse. Vi her beskrive en metode til at analysere og sortere disse pellets i en high-throughput måde. Disse piller kan bruges til yderligere analyser, som vil give fører til at forstå og styre væksten heterogenitet.
Streptomyceter er trådformede jordbakterier, der bruges i industrien til produktion af enzymer og antibiotika. Når der dyrkes i bioreaktorer, disse organismer danner netværk af sammenkoblede hyfer, der er kendt som pellets, som er heterogene i størrelse. Her beskriver vi en metode til at analysere og sortere myceliske træpiller vha. en kompleks objekt Parametric Analyzer og et sorteringsanlæg (Copas). Detaljerede instruktioner er givet for anvendelsen af instrumentet og grundlæggende statistiske analyse af data. Vi beskriver desuden, hvordan træpiller kan sorteres efter brugerdefinerede indstillinger, som gør det muligt downstream forarbejdning, såsom analyse af RNA eller protein-indhold. Ved hjælp af denne metode mekanismen underliggende heterogene vækst kan tackles. Dette vil være medvirkende til at forbedre Streptomyceter som en celle fabrik, i betragtning af, at produktiviteten korrelerer med pellet størrelse.
Streptomycetes er trådformede jordbakterier, der er kendt for deres duelighed til at antibiotika, såvel som forbindelser, der kan anvendes som immunosuppressive midler eller til at bekæmpe svampeinfektioner eller kræft 1,2. Derudover har disse organismer producerer enzymer, der er af interesse for en bred vifte af industrielle applikationer 3. De fleste af disse kommercielt interessante forbindelser produceres i bioreaktorer. Vækst af Streptomyceter i bioreaktorer er karakteriseret ved dannelsen af komplekse strukturer af sammenkoblede hyfer, kendt som klumper eller pellets. Disse flercellede strukturer er meget uensartede med hensyn til størrelse 4 og kan nå størrelser, der er mere end en million gange større end en encellet bakterie som Escherichia coli eller Bacillus subtilis. Selvom heterogenitet betragtes som en gavnlig egenskab i naturlige biologiske systemer 5, anses det for en produktion faldgrube i industrien. Bioreaktor dyrkningen skal være reproducerbar og kontrollerbar for at opnå den højest mulige udbytte. En detaljeret forståelse af den rolle, hver af pillen typer i en bioreaktor er derfor afgørende at forbedre Streptomyceter som en celle fabrik.
Flowcytometri er almindeligt anvendt til at analysere individuelle celler i en population 6. Flowcytometre kan erhverve multiparametric oplysninger ved samtidigt at måle cellernes egenskaber (såsom størrelse, densitet og flerfarvet fluorescens). På denne måde kan celleegenskaber korreleres dermed bidrage til vores forståelse af heterogenitet inden for en kultur og eksistensen af forskellige populationer af celler 6. Mere specialiserede instrumenter har gjort det muligt at sortere celler i overensstemmelse med brugerdefinerede parametre. For eksempel kan mutanter screenes. Efter sortering kan sådanne mutant celler dyrkes til yderligere karakterisering. Det har allerede vist sig at være nyttig, blandt andre,at forbedre produktiviteten af stammer 7,8. Dyserne flowcytometre typisk giver mulighed for passage af celler med en maksimal diameter på ca 10 um. Derfor kan pellets af Streptomyceter ikke analyseres med regelmæssige flowcytometre. De kan dog analyseres med det Complex Object Parametric Analyzer og et sorteringsanlæg (Copas). Ligesom regelmæssige flowcytometre kan Copas erhverve multiparametric data for partikler i et high throughput måde. Afhængigt af typen af copas 10-1,500 um størrelse partikler kan analyseres. Desuden giver det mulighed for sortering af individuelle partikler, der kan anvendes til dyrkning eller efterfølgende analyser, såsom isolering af DNA, RNA eller proteiner. Copas blev oprindeligt udviklet til analyse og sortering af små flercellede organismer, såsom nematode Caenorhabditis elegans 9 og Drosophila embryoner og larver 10. Instrumenterne er også blevet brugt til zebrafisk 11 and for trådsvampe 12,13. Sidstnævnte organismer også danne mycelie-pellets, der er endnu større end dem, der dannes af trådformede bakterier. Vi har for nylig påvist, at anvendelsen af copas er også muligt for Streptomyceter 4. Vi her beskriver den eksperimentelle procedure for brug af copas at vurdere pellet heterogenitet i Streptomyces coelicolor, herunder oplysninger om den metode til at sortere pellets efter størrelse. Bemærk dog, at denne metode også kan bruges til analyse af andre pellet-dannende Streptomyceter.
Flowcytometri har aktiveret high-speed analyse af store antal af enkelte celler, der har bidraget til vores forståelse af heterogenitet i klonpopulationer 6. Regelmæssig flowcytometri er ikke muligt for analyse af de flercellede myceliske pellets af Streptomyceter og svampe. Vores arbejde har vist, at high-throughput analyse af Streptomyces piller er muligt at gøre brug copas. Den her beskrevne procedure er enkel, hurtig og meget reproducerbar. Den kritiske parameter at huske på under drift af instrumentet er strømningshastigheden, som ikke bør overstige 100 arrangementer / sek (trin 3.8 i denne protokol). Hvis koncentrationen pellet, og dermed også strømningshastigheden bliver for høj, vil TOF værdier beregnet forkert, fordi instrumentet ikke kan detektere individuelle pellets. Tilstrækkeligt fortynde prøven ved tilsætning af PBS overvinder dette problem.
Begrænsninger
Den Copas Plus brug d her har en dysediameter på 1 mm, der er egnet til måling af partikler med en størrelse i området fra 30 til 700 um. Denne dyse gør det derfor muligt at måle pellets dannet af streptomycetes. I tilfælde af trådsvampe mikro-kolonier kan være større, hvilket begrænser den generelle anvendelighed af Copas Plus. Den Copas XL kan måle partikler op til 1.500 um i størrelse, men dens følsomhed i det nedre område for diameter er mindre i forhold til det færdige Copas Plus. Både Copas Plus og den Copas XL kan ikke analysere partikler mindre end 30 um. Dette indebærer, at de enkelte mikrobielle sporer eller celler, der ikke kan analyseres. Desuden kan copas ikke nøjagtigt at analysere små aggregater af sporer og celler og de meget små mikro-kolonier. Til dette skal der anvendes regelmæssigt celle analysatorer. Denne begrænsning overvindes ved Biosorter fra Union Biometrica, som kan analysere partikler i området 1-1,500 um. Købet præmie dog er højere.
Betydning og fremtidige retninger
Vi her fokuseret på analysen af pillestørrelse men copas opsætningen er også i stand til at analysere og sortere baseret på fluorescens og tæthed. Fluorescensdetektion muligt for os at analysere genekspression baseret på journalister som GFP. Endvidere kan sammensætningen af celler evalueres. Endnu mere magtfulde er mulighed for at adskille pellets i henhold til disse parameterbreve. Sorteret piller kan bruges til efterfølgende analyser, inklusive alle genomenbaserede studier. Faktisk vi tidligere sorteres 60.000 store og 200.000 små pellets, og viste, at proteomet var signifikant forskellig mellem store og små pellets 4. Denne teknologi giver derfor nye kundeemner til at forbedre Streptomyceter som cellefabrikker.
Den vigtigste fordel ved den Copas teknologi er tid. Tidligere undersøgelser af cellepellets blev udført under anvendelse mikroskopi, og dette begrænser antallet af pellets, der kan analyseres op til flere hundrede 16. Mikroskopi undersøgelser, der allerede antydet eksistensen af to populationer af træpiller i væske-dyrket Streptomyces kulturer 16. Faktisk blev to populationer af pellets påvist uanset dyrkningsbetingelser i et stort antal forskellige Streptomyceter 4. Denne størrelse heterogenitet er ikke begrænset til trådformede Streptomyceter, men blev også observeret i trådet svampe 12 </ Sup>. I alle tilfælde er de underliggende mekanismer heterogenitet endnu ikke kendt. Muligheden for at sortere pellets efter størrelse og fluorescens gør det muligt at optrævle sådanne mekanismer.
The authors have nothing to disclose.
Copas PLUS | Union Biometrica | PLUS | Large particle flow cytometer including lasers and software |
NaCl | Sigma Aldrich | S3014 | PBS component |
KCl | Sigma Aldrich | P9541 | PBS component |
Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S3264 | PBS component |
KH2PO4 | Sigma Aldrich | P9791 | PBS component |
Difco Yeast Extract | BD Biosciences | 210933 | Media component |
Bacto Peptone | BD Biosciences | 211677 | Media component |
Oxoid Malt Extract | Fisher Scientific | OXLP0039B | Media component |
Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | Media component |
Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | Media component |
MgCl2.6H2O | Sigma Aldrich | M2670 | Media components. Add after autoclaving. |
Formaldehyde Solution | Sigma Aldrich | F8775 | Fixation of pellets |
Sodium Hypochlorite Solution | Sigma Aldrich | 71696 | For cleaning of the instrument |
EtOH | VWR | 20816.367 | For cleaning of the instrument |
Erlenmeyer Flask (250 ml) | Fisher Scientific | 214-1132 | Culture flask for growing Streptomyces |
Springs | Verenfabriek De Spiraal | Custom-Made | Used in culture flask. RVS1.4401/Length 210 mm/Diameter 17 mm/Pitch 5 mm |
Sterile Centrifuge Tube (15 ml) | Sarstedt | 62.554.002 | |
Syringes (50 ml) | Sigma | Z683698 |