Bottom-up och Shotgun Proteomics att identifiera en omfattande Cochlear Proteome
Summary
Proteomanalys av cochlea sensoriska epitelet kan vara en utmaning på grund av sin ringa storlek och eftersom membranproteiner är svåra att isolera och identifiera. Både membran och lösliga proteiner kan identifieras genom att kombinera flera preparativa metoder och separationstekniker tillsammans med högupplösande masspektrometri.
Abstract
Proteomik är en vanligt förekommande metod som kan ge insikter i komplexa biologiska system. Den cochlea sensoriska epitel innehåller receptorer som omvandlar den mekaniska energin av ljud i en elektrokemisk energi behandlas av de perifera och centrala nervsystemet. Flera proteomic tekniker har utvecklats för att studera cochlear innerörat, såsom två-dimensionell skillnad gelelektrofores (2D-DIGE), antikropp microarray och masspektrometri (MS). MS är den mest omfattande och mångsidigt verktyg i proteomik och i samband med separationsmetoder kan ge en fördjupad proteomen av biologiska prover. Separationsmetoder kombination med MS har förmågan att berika proteinprover, detektera lågmolekylära och hydrofoba proteiner och identifiera låga förekommande proteiner genom att minska proteomet dynamiskt område. Olika rötningsstrategier kan tillämpas på hela lysat eller fraktionerade protein lysat att öka peptid och proteinsekvenstäckning. Utnyttjande av olika separationstekniker, bland annat stark katjonbytare (SCX), omvänd fas (RP), och gel-elueras flytande fraktion entrapment elektrofores (gelfri) kan tillämpas för att minska prov komplexitet innan MS-analys för proteinidentifiering.
Introduction
Proteomik är studier av komplexa biologiska system genom att analysera proteinuttryck, funktion, modifieringar, och interaktioner 1. Flera metoder har använts för proteomanalys i innerörat, inklusive antikropp microarray 2, två-dimensionell gelelektrofores 3-5 och DIGE 6. Dock har endast ett begränsat antal proteiner identifierats och karakteriserats 2,7-10, jämfört med de över 10.000 gener och uttryckta sekvenstaggar (EST) som identifieras i innerörat 11,12, är MS den vanligaste och omfattande teknik i proteomik för proteinkarakterisering. Analys av komplexa proteomik prover, exempelvis snäckan, kan vara en utmaning. Men kombinationen av multipla separationstekniker med MS möjliggör identifieringen av ett större antal av peptider och proteiner, på grund av en ökad dynamisk koncentrationsintervall och toppkapacitet 13. Multidimensional chromatograPHY minskar mycket komplexa proteinblandningar genom att tillåta användning av olika adsorption mekanismer. Det finns två vanliga MS proteomanalys metoder, hagelgevär och bottom-up-proteomik. I shotgun proteomics, är en blandning av intakta proteiner enzymatiskt digererad och separerades med användning av flerdimensionell kromatografi med starka katjonbytar-kromatografi (SCX) följt av omvänd fas-vätskekromatografi (RPLC) 14,15. De separerade peptiderna utsätts för tandem MS-och databassökning 15. En stor fördel med denna teknik är att tusentals proteiner kan identifieras i en enda analys, och den teknik som är bättre anpassat till membranproteiner.
I bottom-up-strategi, är proteinblandning separeras, vanligen i form av en-eller tvådimensionell elektrofores, och de enskilda proteinbanden eller fläckar klippa ut och smältes med ett enzym såsom trypsin, oftast resulterar i flera peptider. Emellertid har en annan nyarely utvecklat elektro tillvägagångssätt, som används i bottom-up-proteomik, är gelfri. Denna teknik fraktionerar proteinprover i flytande fas och gör dem mindre komplex före analys. Denna teknik är reproducerbar, ger hög proteinutvinning, och reducerar spridningen av höga förekommande proteiner i komplexa proteinprover 16. Peptider, till följd av separerade proteiner, analyseras med MS, med hjälp av peptidmassfingeravtrycks eller tandem MS (MS / MS), för att skapa sekvens taggar för databasen söker 17-19. Några av de stora fördelarna med att använda det underifrånperspektiv är förmågan att få högupplösta separationer och omfattande protein täckning. Bottom-up proteomik är den mest använda tekniken i proteomik 20 därmed flera bioinformatikverktyg är tillgängliga. Dessutom kan proteiner separeras i en komplex blandning före digerering, så det finns en större chans att identifiering.
En av de stora utmaningarnaanvända innerörat för proteomik analys är dess ringa storlek, begränsad tillgänglighet, och celltyp mångfald 21. Dessutom nyckelproteiner som skiljer dess funktionalitet, såsom jonkanaler, transportörer och receptorer, är membranproteiner, som kan vara svåra att isolera 22. Således är förberedelse filter stödd prov (FASP) fördelaktigt för proteomik analyser av vävnader som är begränsade för proteinutvinning och som kräver rengöringsmedel för att lösa membran 23. Denna filtrering gör det möjligt att MS-analys av membran och lösliga proteiner och med avseende på förmågan att isolera peptider från lågmolekylära föroreningar 23,24.
Den nuvarande protokollet beskriver vanligen använda proteomik metoder som kombineras och modifieras för att analysera både lösliga och membranproteiner och att maximera antalet protein ID från cochlea sensoriska epitelet. Vi kommer att beskriva med hjälp av hagelgevär proteomik med FASP multi-smältaion, jonbyteskromatografi, högupplösande MS, och dataanalys. Dessutom kommer vi att beskriva bottom-up proteomik med gelfri, FASP flera matsmältning, högupplösande MS, och dataanalys.
Protocol
Representative Results
Discussion
De viktigaste stegen för att maximera proteinidentifiering från cochlea sensoriska epitel är: 1) användning av flera endoproteinases för matsmältningen, 2) användning av flera separationstekniker, och 3) utnyttjande av en högupplösande masspektrometer. Tillämpningen av ett flertal enzymer ökar antalet peptider och förbättrar proteinsekvens täckning, därmed förbättra antalet identifierade proteiner från cochlea vävnaden. Trypsin, den vanligast använda proteas ger effektiv och specifik klyvning a…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Dr Kent Seeley, chef för Centrum för Drug Discovery och innovation (CDDI) Proteomics Core Facility vid University of South Florida för att använda denna möjlighet. Detta arbete stöddes av NIH / NIDCD bidrag R01 DC004295 till BHAs
Materials
| 8% Tris-acetate cartridge | Protein Discovery | 42103 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Acetonitrile | Honeywell | 015-1L | |
| AEBSF | Calbiochem | 101500 | |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | AC16861 | |
| Aprotinin | Calbiochem | 616370 | |
| ASB-14 | Calbiochem | 182750-5GM | |
| Bovine serum albumin | BioRad | 500-0112 | |
| C18 column | New Objective | A25112 | 75 μm × 10 cm |
| DC Protein Assay | BioRad | 500-0116 | Microplate Assay Protocol |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Endoproteinase Lys-C | Sigma-Aldrich | P3428 | |
| FASP Protein Digestion Kit | Protein Discovery | 44250 | |
| Formic acid | Fluka | 94318 | |
| GELFrEE Fractionation System | Protein Discovery | 42001 | GELFrEE 8100 |
| Leupeptin | Calbiochem | 108975 | |
| MacroSpin Column | The Nest Group | SMM SS18V | Silica C18 |
| Microcystin | Calbiochem | 475815 | |
| Pepstatin | Sigma-Aldrich | P5318 | |
| Polysulfoethyl A Column | The Nest Group | 202SE0503 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sonic Dismembrator | Thermo Fisher | 15-338-53 | Model 100 |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T6567 | Proteomics Grade |
Riferimenti
- Domon, B., Aebersold, R. Review – Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312, 212-217 (2006).
- Jamesdaniel, S., Hu, B., Kermany, M. H., Jiang, H., Ding, D., Coling, D., Salvi, R. Noise induced changes in the expression of p38/MAPK signaling proteins in the sensory epithelium of the inner ear. J. Proteomics. 75, 410-424 (2011).
- Thalmann, I., Hughes, I., Tong, B. D., Ornitz, D. M., Thalmann, R. Microscale analysis of proteins in inner ear tissues and fluids with emphasis on endolymphatic sac, otoconia, and organ of Corti. Electrophoresis. 27, 1598-1608 (2006).
- Thalmann, I., Rosenthal, H. L., Moore, B. W., Thalmann, R. Organ of Corti-specific polypeptides: OCP-I and OCP-II. J. Acoust. Soc. Am. 67, (1980).
- Kathiresan, T., Harvey, M., Sokolowski, B. . The use of two-dimensional gels to identify novel protein-protein interactions in the cochlea. In Auditory and vestibular research : methods and protocols. , (2009).
- Zheng, Q. Y., Rozanas, C. R., Thalmann, I., Chance, M. R., Alagramam, K. N. Inner ear proteomics of mouse models for deafness, a discovery strategy. Brain Res. 1091, 113-121 (2006).
- Peng, H., Liu, M., Pecka, J., Beisel, K. W., Ding, S. J. Proteomic Analysis of the Organ of Corti Using Nanoscale Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry. Int. J. Mol. Sci. 13, 8171-8188 (2012).
- Elkan-Miller, T., Ulitsky, I., Hertzano, R., Rudnicki, A., Dror, A. A., Lenz, D. R., Elkon, R., Irmler, M., Beckers, J., Shamir, R., Avraham, K. B. Integration of Transcriptomics, Proteomics, and MicroRNA Analyses Reveals Novel MicroRNA Regulation of Targets in the Mammalian Inner Ear. Plos One. 6, (2011).
- Yang, Y., Dai, M., Wilson, T. M., Omelchenko, I., Klimek, J. E., Wilmarth, P. A., David, L. L., Nuttall, A. L., Gillespie, P. G., Shi, X. Na+/K+-ATPase α1Identified as an Abundant Protein in the Blood-Labyrinth Barrier That Plays an Essential Role in the Barrier Integrity. . Plos One. 6, (2011).
- Shin, J. B., Streijger, F., Beynon, A., Peters, T., Gadzala, L., McMillen, D., Bystrom, C., Vander Zee, C. E., Wallimann, T., Gillespie, P. G. Hair Bundles Are Specialized for ATP Delivery via Creatine Kinase. Neuron. 53, 371-386 (2007).
- Chen, Z. Y., Corey, D. P. An inner ear gene expression database. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 3, 140-148 (2002).
- Gabashvili, I. S., Sokolowski, B. H., Morton, C. C., Giersch, A. B. Ion channel gene expression in the inner ear. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 8, 305-328 (2007).
- Horvatovich, P., Hoekman, B., Govorukhina, N., Bischoff, R. Multidimensional chromatography coupled to mass spectrometry in analysing complex proteomics samples. J. Sep. Sci. 33, 1421-1437 (2010).
- Ye, M. L., Jiang, X. G., Feng, S., Tian, R. J., Zou, H. F. Advances in chromatographic techniques and methods in shotgun proteome analysis. Trends Anal. Chem. 26, 80-84 (2007).
- Wu, C. C., MacCoss, M. J. Shotgun proteomics: Tools for the analysis of complex biological systems. Curr. Opin. Mol. Ther. 4, 242-250 (2002).
- Bora, A., Anderson, C., Bachani, M., Nath, A., Cotter, R. J. Robust Two-Dimensional Separation of Intact Proteins for Bottom-Up Tandem Mass Spectrometry of the Human CSF Proteome. J. Proteome Res. 11, 3143-3149 (2012).
- Chait, B. T. Mass spectrometry: Bottom-up or top-down. Science. 314, 65-66 (2006).
- Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422, 198-207 (2003).
- Reid, G. E., McLuckey, S. A. Top down’ protein characterization via tandem mass spectrometry. J. Mass. Spectrom. 37, 663-675 (2002).
- Han, X., Aslanian, A., Yates, J. R. Mass spectrometry for proteomics. Curr. Opin. Chem. Biol. 12, 483-490 (2008).
- Thalmann, I. Inner ear proteomics: A fad or hear to stay. Brain Res. 1091, 103-112 (2006).
- Lang, F., Vallon, V., Knipper, M., Wangemann, P. Functional significance of channels and transporters expressed in the inner ear and kidney. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, (2007).
- Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat. Meth. 6, 359-362 (2009).
- Wisniewski, J. R., Zielinska, D. F., Mann, M. Comparison of ultrafiltration units for proteomic and N-glycoproteomic analysis by the filter-aided sample preparation method. Anal. Biochem. 410, 307-309 (2011).
- Darville, L. N., Sokolowski, B. H. In-depth Proteomic Analysis of Mouse Cochlear Sensory Epithelium by Mass Spectrometry. J Proteome Res. 12 (8), 3620-3630 (2013).
- Vizcaino, J. A., Cote, R. G., Csordas, A., Dianes, J. A., Fabregat, A., Foster, J. M., Griss, J., Alpi, E., Birim, M., Contell, J., O’Kelly, G., Schoenegger, A., Ovelleiro, D., Perez-Riverol, Y., Reisinger, F., Rios, D., Wang, R., Hermjakob, H. The PRoteomics IDEntifications (PRIDE) database and associated tools: status in 2013. Nucleic Acids Res. 41, 1063-1069 (2013).
