Isolering av Double Negative αβ T celler fra nyre
Summary
DNabT celler er sjelden blant perifere T-celler; men de er rik på visse ikke-lymfoide vev. Vanskeligheter med å isolere DN T-celler fra ikke-lymfoid vev hindrer deres funksjonell analyse til tross for økende anerkjent patofysiologiske betydning. Vi beskriver en roman protokoll for isolering av høyrensede DN T-celler fra murin nyre.
Abstract
Det er for tiden ingen standard protokoll for isolering av DN T-celler fra de ikke-lymfevev tross sin stadig rapportert engasjement i ulike immunresponser. DN T-celler er en unik immuncelletype som har vært implisert i regulering av immune og autoimmune responser og toleranse for allotransplants 1-6. DN T-celler er imidlertid sjelden i perifert blod og sekundære lymfoide organer (milt og lymfeknuter), men er store beboere i normal nyre. Svært lite er kjent om deres patofysiologiske funksjon 7 på grunn av sin sparsommelige i periferien. Vi har nylig beskrevet en omfattende fenotypiske og funksjonell analyse av denne befolkningen i nyrene 8 i steady state og under iskemi reperfusjonsskade. Analyse av DN T-celle funksjon vil bli sterkt forbedret ved å utvikle en protokoll for deres isolering fra nyrene.
Her beskriver vi en ny protokoll som gjør det mulig isolasjon kon av svært rene ab CD4 + CD8 + T-celler og DN T-celler fra den murine nyre. Kort fortalt, vi fordøye nyrevevet ved hjelp av collagenase og isolere nyre mononukleære celler (KMNC) ved tettshetsgradient. Dette er etterfulgt av to trinn for å berike blodkreft T-celler fra 3% til 70% fra KMNC. Det første trinnet består av en positiv utvelgelse av hematopoetiske celler ved hjelp av et CD45 + isoleringssett. I det andre trinn blir DN T-celler isolert ved negativ fjerning av ikke-ønskede celler ved hjelp av CD4, CD8, og MHC klasse II monoklonale antistoffer og CD1d α-galcer tetramer. Denne strategien fører til en populasjon av mer enn 90% rene DN T-celler. Overflate farging med de ovenfor nevnte antistoffer etterfulgt av FACS-analyse er brukt for å bekrefte renheten.
Introduction
Perifere αβTCR + CD3 + CD4 – CD8 – dobbel-negativ (DN) T-celler er delt inn i ulike undergrupper som besitter forskjellige fenotyper og funksjoner 1-4. DN T-celler er dårlig forstått, men i økende grad innblandet i patofysiologiske immunresponser i ulike sykdomsmodeller 4-6.
DN T-celler er en unik immuncelletype som i økende grad implisert i regulering av en rekke immun-og autoimmunresponser, og modulering av allotransplant toleranse. 4-6, 9. De er sjeldne i perifert blod og sekundære lymfoide organer (milt og lymfeknuter ). Men de er store beboere i normal nyre og tarmepitel 10-12. Svært lite er kjent om deres funksjon 7 i nyrene i steady state og under patologiske tilstander som akutt nyreskade (AKI) forbundet med nyre transplmaur.
På grunn av de intrikate roller i ulike immunceller i å regulere immunreaksjoner inkludert alloresponses, definere rollen for hver spiller er avgjørende for å forstå alloresponses og designe nye behandlingsformer. Gitt de betydelige antall DN T celler i nyrene etter fysiologiske og ulike sykdomstilstander, DN T-celler er sannsynlig å spille en avgjørende rolle i å regulere immunsystemet og autoimmune reaksjoner i mus og mennesker, og alloresponses i resipienter. Samlende men fortsatt spredte bevis impliserer DN T-celler i både patogene og immunsupprimerende funksjoner, men det er dårlig forstått hvorfor og hvordan de viser en spesifikk skadelig eller undertrykkende funksjon og hvordan miljøet påvirker dem.
På grunn av deres lave overflod i nyrene, forbedrede fremgangsmåter for isolering er nødvendig.
Det er for tiden ingen standard protokoll for isolering av DN T-celler fra than ikke lymfevev. Vår protokoll beskriver en ny fremgangsmåte for isolering av DN T-celler fra nyrene; Imidlertid kan fremgangsmåten også brukes for en rekke ikke-lymfoide vev.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det er økende interesse for DN T-celler, siden de blir innblandet i forskjellige patologiske tilstander slik som autoimmune sykdommer, kreft, transplantat-toleranse, og primær sykdommer i nyre inkludert akutt nyre-skade (AKI), glomerulonefritt 8, 13. Derfor er det behov for å bedre forstå og karakterisere pathophysiologic funksjonene til DN T-celler. Men for tiden er det en mangel på forståelse av disse cellenes funksjon i forhold til CD4 og CD8 T-celler. En viktig årsak er mangelen på DN T-celler i s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet støttes av NIH PBS (R21 AI095484). Vi takker NHI tetramer kjernefasilitet for CD1d tetramer.
Materials
| Laminar flow hood | Baker Company, Inc | Or equivalent equipment | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Or equivalent equipment | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-11 | |
| Atmosphere-controlled incubator | Fisher Scientific | (37°C with 5% CO2) | |
| Microscope | Olympus | Or equivalent equipment | |
| Analytical flow cytometer | LSR II | ||
| Name of the reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Media Tech | 10-040-CV | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Fetal bovine serum | Corning Cellgro | 35-011-CV | |
| 0.1% sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Buffer phosphate buffered saline (PBS) | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| PBS 10X | Mediatech | 46-013-CM | |
| EDTA buffer | Sigma-Aldrich | E1161 | |
| LS columns | MiltenyiBiotec | 130-042-401 | |
| CD45+ microbeads | MiltenyiBiotec | 6.78E-51 | |
| Biotin microbeads | MiltenyiBiotec | 130-090-485 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) PerCP | eBioscience | G1397 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) APC-Cy7 | Biolegend | 103116 | |
| anti-TCR Pacific Blue (ab-chain, clone: H57-597) | Invitrogen | HM3628 | |
| anti-CD4 PE | eBioscience | 12-0043 | |
| anti-CD8 FITC | eBioscience | 8011-0087 | |
| anti-CD4 biotinylated (GK1.5) | BD | 553728 | |
| anti-CD8 biotinylated (clone 53-6.7) | BD | 553029 | |
| anti-Fc receptor (CD16/32) biotinylated | BD | 553143 | |
| anti-MHC class II (I-A d) biotinylated | BD | 553609 | |
| anti-CD1d PBS-57 tetramer | NHI tetramer | lote # 15621-PBS57 | |
| AutoMACS Running Buffer- MACS Separation Buffer | MIlteny I Biotec | 130-091-221 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Labs | 000664 | Kidneys – Lymph Nodes |
| Petri dish | BD Biosciences | 356517 | |
| 70mc filter | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Plunger | Or equivalent equipment | ||
| GeneMate Tubes 50 ml | Bioexpress | C-3394-3 | Or equivalent equipment |
| GeneMate Tubes 15 ml | Bioexpress | C-3394-1 | Or equivalent equipment |
| Petri Dish | Fisher Scientific | S33580 | |
| Plate 24 wells | BD Biosciences | 354723 |
Riferimenti
- Zhang, Z. X., Yang, L., Young, K. J., DuTemple, B., Zhang, L. Identification of a previously unknown antigen-specific regulatory T cell and its mechanism of suppression. Nat Med. 6, 782-789 (2000).
- Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, Z., Ohashi, P. S., Zhang, L. The immune regulatory function of lymphoproliferative double negative T cells in vitro and in vivo. J Exp Med. 196, 261-267 (2002).
- Ford McIntyre, M. S., Young, K. J., Gao, J., Joe, B., Zhang, L. Cutting edge: in vivo trogocytosis as a mechanism of double negative regulatory T cell-mediated antigen-specific suppression. J Immunol. 181, 2271-2275 (2008).
- Young, K. J., Yang, L., Phillips, M. J., Zhang, L. Donor-lymphocyte infusion induces transplantation tolerance by activating systemic and graft-infiltrating double-negative regulatory T cells. Blood. 100, 3408-3414 (2002).
- Chen, W., Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, L. Infusion of in vitro-generated DN T regulatory cells induces permanent cardiac allograft survival in mice. Transplant Proc. 35, 2479-2480 (2003).
- Young, K. J., DuTemple, B., Phillips, M. J., Zhang, L. Inhibition of graft-versus-host disease by double-negative regulatory T cells. J Immunol. 171, 134-141 (2003).
- Mohamood, A. S., et al. Gld mutation of Fas ligand increases the frequency and up-regulates cell survival genes in CD25+CD4+ TR cells. Int Immunol. 18, 1265-1277 (2006).
- Ascon, D. B., et al. Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire. J Leukoc Biol. 84, 1400-1409 (2008).
- Hamad, A. R., et al. B220+ double-negative T cells suppress polyclonal T cell activation by a Fas-independent mechanism that involves inhibition of IL-2 production. J Immunol. 171, 2421-2426 (2003).
- Rabb, H., et al. Pathophysiological role of T lymphocytes in renal ischemia-reperfusion injury in mice. Am J Physiol-Renal. 279, 525-531 (2000).
- Burne, M. J., et al. Identification of the CD4(+) T cell as a major pathogenic factor in ischemic acute renal failure. J Clin Invest. 108, 1283-1290 (2001).
- Yokota, N., Daniels, F., Crosson, J., Rabb, H. Protective effect of T cell depletion in murine renal ischemia-reperfusion injury. Transplantation. 74, 759-763 (2002).
- Crispin, J. C., et al. Expanded double negative T cells in patients with systemic lupus erythematosus produce IL-17 and infiltrate the kidneys. J Immunol. 181, 8761-8766 (2008).
- Igarashi, S., Takiguchi, M., Kariyone, A., Kano, K. Phenotypic and functional analyses on T-cell subsets in lymph nodes of MRL/Mp-lpr/lpr mice. Int Arch Allergy Appl Immunol. 86, 249-255 (1988).
- Dowdell, K. C., et al. Somatic FAS mutations are common in patients with genetically undefined autoimmune lymphoproliferative syndrome. Blood. 115, 5164-5169 (2010).
- Juvet, S. C., et al. FcRgamma promotes T cell apoptosis in Fas-deficient mice. J Autoimmun. 42, 80-93 (2013).
- Thomson, C. W., et al. FcR gamma presence in TCR complex of double-negative T cells is critical for their regulatory function. J Immunol. 177, 2250-2257 (2006).
