Questo manoscritto presenta una tecnica per applicare o liberare forze su cellule o tessuti aderenti usando allungamento unidirezionale.
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Articolo metodologico
Stretching celle micropatterned su una membrana PDMS
In questo articolo
Sommario
Abstract
Forze meccaniche esercitate sulle cellule e / o tessuti svolgono un ruolo importante in numerosi processi. Abbiamo sviluppato un dispositivo di allungare le cellule placcato su un polidimetilsilossano (PDMS) membrana, compatibile con le immagini. Questa tecnica è riproducibile e versatile. La membrana PDMS può essere micropatterned al fine di limitare cellule o tessuti di una geometria specifica. Il primo passo è stampare microdisegnature sulla membrana PDMS con una tecnica UV profondo. La membrana PDMS è poi montato su un telaio meccanico. Una camera è vincolata in cima alla membrana con grasso biocompatibile per consentire scivolare durante l'allungamento. Le cellule vengono seminate e ha permesso di diffondere per diverse ore sui microdisegnature. Il campione può essere allungato e non deformato più volte con l'uso di una vite micrometrica. Ci vuole meno di un minuto per applicare il tratto per tutta la sua estensione (circa il 30%). La tecnica qui presentata non include un dispositivo motorizzato, che è necessario per unapplying cicli tratto ripetuti rapidamente e / o computer controllato stretching, ma questo può essere attuato. Stretching di cellule o di tessuto può essere di interesse per le questioni relative alle forze cellulari, risposta cellulare allo stress meccanico o morfogenesi dei tessuti. Questa presentazione video mostra come evitare i problemi tipici che potrebbero sorgere quando si fa questo tipo di apparentemente semplice esperimento.
Introduzione
Le cellule che compongono un tessuto in organismi superiori sono soggetti a tensioni meccaniche e forze traenti o provenienti dall'ambiente esterno o da cellule circostanti 1,2. Cellule devono adattarsi e resistere a queste forze al fine di mantenere l'integrità del tessuto. Tali forze sono importanti anche per i tessuti morfogenesi durante lo sviluppo 3,4. Applicando forze meccaniche su cellule coltivate è un modo di imitare ciò che potrebbe accadere in un tessuto, ma con un controllo quantitativo e indipendente di forma delle cellule e deformazione cella 5,6. Per questo, possono essere utilizzate diverse tecniche. Si può pre....
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Protocollo
1. Passivazione del PDMS
- Tagliare un pezzo di PDMS circa 35 mm x 20 mm da una lamiera pre fatta (per esempio, GelPak, come elencato nella tabella dei materiali).
- Rimuovere la parte superiore e gli strati protettivi peggiori di plastica (se necessario) e usare pinzette per posizionare i PDMS in plastica (non COLTURA CELLULARE trattati) piastra Petri.
- Lavare le PDMS con etanolo al 70% per 5 minuti su un agitatore a 30 oscillazioni / min.
- Asciugare la superficie scorre aria su di esso.
- Illuminare con profondo UV (λ = 180 nm) per 5 minuti a una distanza dalle lampade UV di circa 5 cm (vedi scheda Materiali per riferiment....
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Risultati
La tecnica presentata in questo protocollo video consentiva l'applicazione di forze sulle fibre di retrazione di cellule di mammifero mitotiche. Infatti, durante la divisione cellulare, allo stadio mitotico, cellule di mammifero ritraggono a prendere la forma di una sfera e di lasciarsi alle spalle i cavi di actina sottili circondate da una membrana che sono attaccati al substrato. Questi cavi (fibre di retrazione), sono la memoria della geometria della cella prima di andare in divisione. Fare microdisegnature.......
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Discussione
Sebbene questa tecnica è stata utilizzata numerose volte e viene accuratamente testato, ci sono diversi passaggi critici che possono portare ad un esperimento fallito.
Circa il PDMS:
Per questo lavoro, GelPak, un foglio sottile PDMS disponibile in commercio, è stato utilizzato. In alternativa, i fogli di PDMS possono essere lanciate direttamente dalla miscela PDMS. Si consiglia di utilizzare GelPak perché è più riproducibile, ed è meno probabilità di rottura rispett.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato fondato da Institut Curie, Parigi, Francia. La barella meccanico è stato progettato da Damien Cuvelier (Institut Curie) ed è prodotto da GREM (mecanique-grem.com). Il patterning su PDMS è stato sviluppato da Ammar Azioune (Bordeaux II University).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| GelPak | GelPak | PF-60-X4 | Sono disponibili diversi spessori/viscosità. Un'alternativa potrebbe essere quella di lanciare il tuo PDMS tu stesso. |
| Grasso siliconico | GE Bayer Siliconi | Baysilone-Paste | Questo è biocompatibile |
| Dispositivo di stiramento | GREM mé barella canique | 2011 | |
| EDC (N-(3-Dimetilamminopropil)-N′-etilcarbodiimmide cloridrato) | Sigma | 3450 | Stabile 6 mesi a -20 ° C |
| NHS (N-Idrossisulfosuccinimide sale sodico) | Sigma | 56485 | Proteggere dall'umidità |
| Pll-g-peg (PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) 20 mg) | SurfaceSolutions (Zurigo) | ||
| Fotomaschera al quarzo sintetico | Toppan | Prendi la fotomaschera binaria standard in Quarzo | |
| Fibronectina dal plasma bovino | Sigma | F1141 |
Riferimenti
- Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 265-275 (2006).
- Terenna, C. R., et al. Physical mechanisms redirecting cell polarity and cell shape in fission yeast. Curr. Biol. 18
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Ristampe e permessi
