从人骨骼肌隔离血管源性多能前体

Summary

人体骨骼肌肉的海港几个多系前驱体的人口，是理想的可再生应用血管内。这种隔离方法允许3多能前体细胞群的同时纯化分别从血管三个结构层次：从内膜肌内皮细胞，从媒体的周细胞，并从外膜外膜细胞。

Abstract

由于间充质干细胞/基质细胞（MSCs）的发现，本土身份和干细胞的定位一直被掩盖着他们的文化追溯隔离。近年来，使用荧光激活细胞分选（FACS），我们和其他研究人员前瞻性地识别和纯化的人类骨骼肌的脉管系统相关联的多能前体细胞三个亚群。这三个细胞群：肌内皮细胞（的MECs），周细胞（PCS）和外膜细胞（ACS），分别定位于血管的三个结构层次：内膜，媒体和外膜。所有这些人的血管源性干细胞（hBVSC）的人群，不仅表达经典的MSC标志，而且具有类似于典型的中胚层干细胞的发育潜能。此前，的MECs，PC和无线控制器已经通过不同的协议隔离，随后其特征在于，独立的研究。当前隔离普罗特ocol，通过修改隔离工艺和调整的选择性细胞表面标志物，可以让我们同时净化三个hBVSC亚群流式细胞仪从一个单一的人体肌肉活检。这种新方法不仅简化多个BVSC亚群的隔离也方便hBVSCs为不同的治疗目的，未来的临床应用。

Introduction

人体骨骼肌肉一直被认为是一种临床上有吸引力的干/祖细胞的来源。骨骼肌包含不仅致力于肌祖细胞，成肌细胞，而且原始肌干细胞，包括卫星细胞和肌源性干细胞（肌源性干细胞^）1。利用人体肌源性干细胞/祖细胞，自体或异体，在再生医学的已被广泛地研究在临床前动物模型和临床试验。肌肉干细胞/祖细胞的再生应用范围从再生在杜兴肌营养不良（DMD）患者的营养不良的肌肉来修复患者的受损心脏与心脏发作。

自间充质干细胞/基质细胞（MSC）和其它多能前体细胞群，其中包括骨髓来源的多能成体祖细胞（MAPC的）和脂肪来源的干细胞（ADSC中），成体干/的发现祖细胞已被广泛研究，以时间^1-9。然而， 在原地家乡的身份和定位一直被掩盖着的回顾性分离方法。近年来，使用荧光激活细胞分选（FACS），我们和其他团体已前瞻性地确定和纯化3多能来自于人骨骼肌血管和其它几种器官的前体细胞群：肌源性内皮细胞（的MECs），周细胞（如PC），和外膜细胞^{（ACS）10。}内膜，中膜和外膜：人类血管来源的干细胞（hBVSCs）这三个亚群可以在血管中的三个结构层可以分别找到。更具体地讲，的MECs和PC的微血管和毛细血管被检测，而AC均为定位于较大的动脉和静脉外膜层。每个前体细胞亚群表达的细胞表面抗原的独特组合：的MECs（CD34 ⁺ / 56 ⁺ / 144 ⁺ / 45 ^{– ），}个人电脑（CD146 ⁺ / 34 ^– / 45 ^– / 56 ^{– ），}和AC（CD34 ⁺ / 31 ^– / 45 ^– / 56 ^– / 146 ^{– ）。}

这些hBVSC亚群的进一步鉴定表明，所有三个前体细胞群具有类似于典型的干细胞，包括骨骼肌肉发育，成骨，软骨，脂肪形成和中胚层发育的潜力。所有hBVSC子集也表现出经典的MSC标志，包括CD44，CD73，CD90，和CD105，新鲜和文化。总的来说这些证据支持干细胞的血管起源。此外，的MECs，PC和无线控制器的治疗能力，最近被证明在独立的研究。排序的MECs从成人的肌肉活检显示再生受伤，营养不良骨骼肌和修复受损的心肌更有效地比骨骼肌成肌细胞和血管内切thelial细​​胞（EC）。从不同的人体器官纯化的电脑也已显示修复/再生损伤和营养不良骨骼肌和向卫星细胞池^13-16。最近，我们已经证明，从人骨骼肌来源的电脑有效修复通过间接的旁分泌作用和直接的细胞相互作用¹⁷的梗塞心肌。 AC的，另一方面，已经可以直接分离自外植血管或通过FACS从人脂肪组织和骨骼肌纯化。 AC的一个显着的促血管生成作用表现在小鼠后肢缺血模型^19。此外，无线控制器也被证明比传统的MSC更有效地修复心肌梗死，表示在局部缺血组织修复²⁰ AC的鲁棒治疗潜力。

目前的纯化方案补助的同时，的MECs，个人电脑未来的净化和AC的从一个人类骨骼肌活检的血管。这使我们能够研究和/或选择最佳的hBVSC亚群的不同的治疗目的。此外，这种新技术进一步扩大，可从人骨骼肌衍生干细胞/祖细胞的剧目，使得它的多能前体细胞用于再生医学的一个理想的来源。

Protocol

1，肌肉活检处理保存在冰上人骨骼肌活检中的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM），补充有5％胎牛血清（FBS）和1％青霉素 – 链霉素运输过程中（P / S）。 在接收到肌肉活检后，除去从运输容器中的检体和在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中补充有在无菌条件下的2％抗生素 – 抗真菌溶液（A / A）的两次洗涤。 除去附着的脂肪和结缔组织，用无菌剪刀和镊子的DMEM补充有2％A / A。 解剖…

Representative Results

基于来自未染色的对照，阴性对照，以及单色阳性对照而获得的数据的FACS参数被首先校正。排除死细胞后，荧光标记的细胞悬浮液进行了一系列的阴性和阳性的细胞表面标记物的选择。首先，CD45 +细胞被选通的CD56 +和CD56前-细胞从CD45分离的-部分。的CD56 +级分进一步进行CD34-CD144的选择，其中只有CD34 + / CD144 +（双阳性）细胞中被标记为的MECs…

Discussion

hBVSC亚群的鉴定和纯化代表海安个体发育的理解的一个重大进展。有越来越多的证据表明MSCs的血管周围的起源和组织特异性前体细胞和血管^22-25之间的关联。此外，容量以分离均相亚hBVSCs的进一步有助于MSC异质性和血管细胞生物学²⁶的理解。

在过去的几年中，的MECs，PC和无线控制器已经被单独识别并通过独立的研究不同的协议隔离。然而，没有尝试了同时净?…

Materials

Collagenase Type 1	Sigma	C5894	Sterile vial
Collagenase Type 2	Sigma	C1764	Sterile vial
Collagenase Type 4	Sigma	C1889	Sterile vial
Anti-human CD34 APC	BD Pharmingen	555824	Keep sterile
Anti-human CD45 APC-Cy7	BD Pharmingen	557833	Keep sterile
Anti-human CD56 PE-Cy7	BD Pharmingen	557747	Keep sterile
Anti-human CD144 PE	Beckman Coulter	A07481	Keep sterile
Anti-human CD146 FITC	AbD Serotec	MCA2141F	Keep sterile
FACSAria II Flow Cytometer	Becton-Dickinson
EGM-2 Complete Medium	Lonza	CC-3162	For culturing PCs (only P0)
DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate	Invitrogen	11965	For culturing PCs
DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, with sodium pyruvate	Invitrogen	11995	For culturing MECs and ACs
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	10437-028
Heat-inactivated horse serum	Invitrogen	26050-088
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Antibiotic-Antimycotic (100X)	Invitrogen	15240-062
Trypsin-EDTA 0.5%(10X)	Invitrogen	15400-054
Dulbecco’s PBS without calcium and magnesium	Invitrogen	14190-250
Chick embryo extract	Accurate Chemical	CE650T-10	Filter before use