FIBS-enabled Noninvasive metabole
Summary
Een beschrijving van hoe je Förster Resonance Energy Transfer geïntegreerde biologische sensoren (FIBS) kalibreren voor in situ metabool profiel wordt gepresenteerd. De FIBS kan worden gebruikt om de intracellulaire niveaus van metabolieten invasief leveren aan de ontwikkeling van metabole modellen en hoge doorvoer screening van bioproces omstandigheden te meten.
Abstract
In het tijdperk van de computationele biologie, nieuwe high throughput experimentele systemen die nodig zijn om aan te vullen en te verfijnen modellen, zodat ze kunnen worden gevalideerd voor voorspellende doeleinden. Idealiter dergelijke systemen zou een laag volume, dat de bemonstering en destructieve analyses in de weg staat wanneer de tijd cursus data zijn te verkrijgen zijn. Wat nodig is, is een in situ monitoring tool die de nodige informatie in real-time en niet-invasief te kunnen melden. Een interessante optie is het gebruik van fluorescente, basis van eiwitten in vivo biologische sensoren als reporters intracellulaire concentraties. Een specifieke klasse van in vivo biosensoren die toepassingen heeft in metaboliet kwantificering is gebaseerd op Förster Resonance Energy Transfer (FRET) tussen twee fluorescente eiwitten verbonden door een ligand bindend domein. FRET geïntegreerde biologische sensoren (FIBS) worden constitutief geproduceerd binnen de cellijn, ze hebben snelle responstijden en hun spectrale chagenschappen veranderen gebaseerd op de concentratie van metaboliet in de cel. In dit artikel wordt de werkwijze voor het construeren van de Chinese hamster ovarium (CHO) cellijnen die constitutief een FIBS glucose en glutamine en kalibreren van de FIBS in vivo in batch celkweek om toekomstige kwantificering van intracellulaire metaboliet concentratie inschakelen beschreven. Gegevens van fed-batch CHO celkweken aantoont dat de FIBS kon telkens de resulterende verandering in de intracellulaire concentratie detecteren. De fluorescerende signaal van de FIBS en de eerder geconstrueerde ijkcurve werd de intracellulaire concentratie nauwkeurig bepaald bevestigd door een onafhankelijke enzymatische test.
Introduction
Metaboliet controle heeft diverse toepassingen in bioprocessing, inclusief procesontwikkeling, media en diervoeders ontwerp en metabolic engineering. Verschillende werkwijzen zijn beschikbaar voor concentratiemetingen door middel van enzymatische 1, 2 chemisch of bindingstesten 3. Een interessante optie is het gebruik van fluorescente, basis van eiwitten in vivo biologische sensoren als reporters van de intracellulaire concentratie van belangrijke metabolieten. In ultra-low volume assays, fluorescentie is een handig hulpmiddel als miniaturisatie feite verbetert de signaal-ruisverhouding 4,5 en eiwit gebaseerde sensoren kunnen genetisch gecodeerd zin dat geen exogene reagens nodig metabolietanalyse zijn. Förster Resonance Energy Transfer (FRET) biosensoren uit twee fluorescerende eiwitten verbonden door een ligand bindend domein. FRET is een nonradiative overdracht van energie van een foto-enthousiast donor naar een acceptor fluorescerend molecuul locat ed in de nabijheid (<100). Ligand splitsing of binding veroorzaakt een conformationele verandering in de sensor, die op zijn beurt veroorzaakt een verandering in de nabijheid van de fluoroforen, wat leidt tot een verandering in FRET efficiëntie gemeten door de verandering in het emissiespectrum. FRET geïntegreerde biologische sensoren (FIBS) wordt constitutief geproduceerd in de cellijn en de spectrale eigenschappen veranderen gebaseerd op de concentratie van metaboliet in de cel. FIBS hebben snelle responstijden waardoor ze ideaal zijn voor het nemen van metingen van dynamische modellen 6. Vorige toepassingen zijn onder meer het toezicht op enkele 7-9 en meerdere 10 metabolieten en het verstrekken van gegevens over de tijdruimtelijke verdeling 11. FIBS kunnen worden gemaakt in twee configuraties: Apo-Max, wanneer ligandbinding verstoort de nabijheid van de fluoroforen verlagen energieoverdracht en Apo-Min, wanneer ligandbinding brengt de twee fluoroforen in nauwer contact (figuur 1).
_content "> In dit werk wordt een protocol gepresenteerd voor de bouw van Chinese hamster ovarium (CHO) cellijnen die constitutief een FIBS voor een metaboliet, glucose of glutamine. Een methodologie vastgesteld voor de kalibratie van de sensor in vivo om toekomstige kwantitatieve staat metingen van intracellulaire metaboliet concentratie zoals aangegeven in figuur 2. Op basis daarvan de intracellulaire concentratie van glucose of glutamine kan worden bepaald fed-batch CHO celkweken, waarbij de twee nutriënten werden toegevoegd in hoge concentraties in het proces. de resultaten blijkt dat met het fluorescerende signaal van de FIBS en de eerder geconstrueerde ijkcurve nauwkeurig voorspellen van de intracellulaire concentratie mogelijk, zoals bevestigd door een onafhankelijke enzymatische test. Deze methode biedt aanzienlijke voordelen boven de huidige analytische technieken omdat het invasieve, goedkope en snel, het geven van een real-time signaal van de FIBS die maan kan zijnitored de hele cultuur.Protocol
Representative Results
Discussion
De FIBS mogelijk in vivo en in situ kwantificering van sleutelmoleculen in casu groei beperkende voedingsstoffen, onzekerheden van gevolg van afschrikken en extractiemethoden. De resultaten suggereren dat er een goede correlatie tussen de FIBS signaal en de intracellulaire concentraties in het traject van 1-5 mM glucose en 0.3-2 mM glutamine. In batch CHO-celkweek, zijn deze concentraties aangetroffen in de exponentiële, stationaire en vroege daling fasen. De exponentiële en stationaire fasen zijn de…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Professor Wolf Frommer (Carnegie Institution for Science, Stanford University) voor vriendelijk ons met de glucose FRET plasmide en Dr Uwe Ludewig (Universität Hohenheim) voor vriendelijk het leveren van de glutamine FRET bouwen in de pUTKan plantenexpressievector. AB wordt gefinancierd door de BBSRC Gerichte Priority Studentships programma. Zowel CK en KP worden ondersteund door RCUK beurzen in Biopharmaceuticals Processing. CK wil ook Lonza Biologics bedanken voor hun financiële steun. Het Centrum voor Synthetische Biologie en Innovatie is royaal ondersteund door de EPSRC.
Materials
| CHO-S Cells | Life Tecnologies | 11619-012 | Cell line will vary depending on the goals of the study |
| pCDNA4/TO vector | Life Tecnologies | ||
| TransIT-PRO Transfection Reagent | Mirus Bio | MIR 5700 | Transfections can be accomplished using any method suitable for the cell line under study |
| Zeocin | Invivogen | ||
| CD-CHO medium | Life Technologies | 10743-011 | Cell growth medium is dependent upon the cells under study |
| 100X HT Supplement | Life Technologies | 11067-030 | |
| L-Glutamine 200 mM (100X), Liquid | Life Technologies | 25030032 | |
| InfinitePRO 200 plate reader | Tecan | FLx800TBI | Any 96-well fluorescence plate reader that can access the required wavelengths can be substituted |
| Filters for plate reader | Tecan | 30000463 | |
| (520NM BW 10NM) | |||
| 30022786 | |||
| (430NM BW 35NM) | |||
| 30022787 | |||
| (465NM BW 35NM) | |||
| Maxiprep Plasmid Purification Kit | Qiagen | 12163 | Any suitable kit can be substituted |
| Amplex Red glucose/glucose oxidase assay kit | Invitrogen | A22189 | Any suitable kit can be substituted |
| EnzyChrom Glutamine Assay Kit | BioAssay systems | EOAC-100 | Any suitable kit can be substituted |
| Improved Neubauer haemocytometer | Fisher Scientific | MNK-420-010N | |
| Incubator | Nuaire | NU-5510E |
Riferimenti
- Moser, I., Jobst, G., Urban, G. A. Biosensor arrays for simultaneous measurement of glucose, lactate, glutamate, and glutamine. Biosens. Bioelectron. 17 (4), 297-302 (2002).
- Billingsley, K., et al. Fluorescent nano-optodes for glucose detection. Anal. Chem. 82 (9), 3707-3713 (2010).
- Dattelbaum, J. D., Lakowicz, J. R. Optical Determination of Glutamine Using a Genetically Engineered Protein. Anal. Biochem. 291 (1), 88-95 (2001).
- Kfouri, M., et al. Toward a miniaturized wireless fluorescence-based diagnostic imaging system. IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 14 (1), 226-234 (2008).
- Dittrich, P. S., Manz, A. Single-molecule fluorescence detection in microfluidic channels—the Holy Grail in muTAS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 382 (8), 1771-1782 (2005).
- Hou, B. H., Codamo, J., Pilbrough, W., Hughes, B., Gray, P. P., Munro, T. P. Optical sensors for monitoring dynamic changes of intracellular metabolite levels in mammalian cells. Nat. Protoc. 6 (7), 1818-1833 (2011).
- Bermejo, C., Haerizadeh, F., Takanaga, H., Chermak, D., Frommer, W. B. Dynamic analysis of cytosolic glucose and ATP levels in yeast using optical sensors. Biochem. J. 432, 399-406 (2010).
- Yang, H. Y., Bogner, M., Stierhof, Y. D., Ludewig, U. H(+)-independent glutamine transport in plant root tips. Plos One. 5, (2010).
- Fehr, M., Takanaga, H., Ehrhardt, D. W., Frommer, W. B. Evidence for high-cavacity bidirectional glucose transport across the endoplasmic reticulum membrane by genetically encoded fluorescence resonance energy transfer nanosensors. Mol. Cell. Biol. 25 (24), 11102-11112 (2005).
- Ai, H. W., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Fluorescent protein FRET pairs for ratiometric imaging of dual biosensors. Nat. Methods. 5 (5), 401-403 (2008).
- Ouyang, M. X., Sun, J., Chien, S., Wang, Y. X. Determination of hierarchical relationship of Src and Rac at subcellular locations with FRET biosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14353-14358 (2008).
- Han, Y., et al. Cultivation of recombinant Chinese hamster ovary cells grown as suspended aggregates in stirred vessels. J. Biosci. Bioeng. 102 (5), 430-435 (2006).
- Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering. Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).
- Wong, D. C. F., Wong, N. S. C., Goh, J. S. Y., May, L. M., Yap, M. G. S. Profiling of N-Glycosylation gene expression in CHO cell Fed-batch cultures. Biotechnol. Bioeng. 107 (2), 516-528 (2010).
- Behjousiar, A., Kontoravdi, C., Polizzi, K. M. In Situ Monitoring of Intracellular Glucose and Glutamine in CHO Cell Culture. PLoS One. 7, (2012).
- Dwyer, M. A., Hellinga, H. W. Periplasmic binding proteins: a versatile superfamily for protein engineering. Curr. Opin. Struct. Biol. 14 (4), 495-504 (2004).
