FIBS מאופשר פולשנית מטבולית פרופיל
Summary
תיאור כיצד לכייל את חיישני העברת פורסטר התהודה האנרגיה משולבים ביולוגיים (FIBS) בפרופיל מטבולי אתר מוצג. FIBS ניתן להשתמש כדי למדוד את הרמות תאית של מטבוליטים noninvasively סיוע בפיתוח מודלים מטבוליים והקרנת תפוקה הגבוהה של תנאי Bioprocess.
Abstract
בעידן של ביולוגיה חישובית, מערכות ניסיוניות תפוקה גבוהה חדשות הן הכרחיות על מנת לאכלס ולשפר דגמים, כך שהם יכולים להיות תוקף למטרות חזויה. באופן אידיאלי מערכות כאלה יהיו בנפח נמוך, שאינו מאפשר ניתוח דגימה והרסני כאשר הנתונים כמובן זמן הם כדי להתקבל. מה שדרוש הוא בכלי ניטור אתר שיכול לדווח את המידע הדרוש בזמן אמת וnoninvasively. אופציה מעניינת היא השימוש בניאון, בחיישנים ביולוגיים vivo ככתבים של ריכוזים תאיים המבוסס על חלבונים. סוג מסוים אחד in vivo biosensors כי יש למצוא יישומים בכימות המטבוליט מבוסס על העברת פורסטר התהודה אנרגיה (סריג) בין שני חלבוני ניאון מחוברים על ידי תחום מחייב ליגנד. סריג חיישנים משולבים ביולוגיים (FIBS) מיוצר constitutively בתוך הקו הסלולרי, יש להם זמני תגובה מהירה וצ'ה הרפאים שלהםracteristics לשנות מבוסס על הריכוז של המטבוליט בתוך התא. במאמר זה, השיטה לבניית השחלה אוגר סינית (CHO) שורות תאים שconstitutively להביע FIBS לגלוקוז וגלוטמין וכיול FIBS in vivo בתרבית תאים אצווה על מנת לאפשר כימות עתיד של ריכוז המטבוליט תאיים מתוארת. נתונים מתרביות תאים האכילו אצווה CHO מוכיחים כי FIBS הצליח בכל מקרה כדי לזהות את השינוי וכתוצאה מכך הריכוז תאיים. השימוש באות הניאון מהשקרים ואת עקומת הכיול שנבנה בעבר, הריכוז תאיים היה מדויק ייקבע כפי שאושר על ידי assay אנזימטי עצמאי.
Introduction
יש ניטור המטבוליט יישומים שונים בbioprocessing, כוללים פיתוח תהליך, תקשורת ועיצוב מזון, והנדסה מטבולית. שיטות שונות זמינות עבור מדידות ריכוז באמצעות האנזימטית 1, 2 כימי, או מבחני מחייבים 3. אופציה מעניינת היא השימוש בניאון, בחיישנים ביולוגיים vivo ככתבים של הריכוז תאיים של מטבוליטים מפתח המבוסס על חלבונים. במבחני נפח נמוכים במיוחד, הקרינה היא כלי נוח כמו מזעור ממש משפר את 4,5 יחס אות לרעש וחיישנים המבוססים על חלבונים יכולים להיות מקודד גנטי משמעות שאין חומרים כימיים אקסוגניים נחוצים לניתוח המטבוליט. biosensors העברת פורסטר התהודה אנרגיה (סריג) מורכב משני חלבוני ניאון מחוברים על ידי תחום מחייב ליגנד. סריג הוא העברת nonradiative של אנרגיה מתורם צילום נרגש locat מולקולת ניאון acceptor אד בסמיכות (<100). מחשוף יגנד או מחייבים גורם לשינוי קונפורמציה בחיישן, אשר, בתורו, גורם לשינוי בקרבתו של fluorophores, מה שמוביל לשינוי בסריג יעילות שנמדד על ידי השינוי בספקטרום הפליטה. חיישני סריג משולבים ביולוגיים (FIBS) מיוצרים constitutively בתוך קו התא והמאפיינים ספקטרליים שלהם לשנות מבוססים על הריכוז של המטבוליט בתוך התא. יש לי FIBS זמני תגובה מהירה שהופך אותם אידיאליים עבור מדידות לדגמים דינמיים 6. יישומים קודמים כוללים ניטור אחת 7-9 ומרובים 10 מטבוליטים ומספקים נתונים על חלוקת spatiotemporal 11. ניתן ליצור FIBS בשתי תצורות: Apo-מקס, שבו ליגנד מחייב משבש את הקרבה של fluorophores הפחתת העברת אנרגיה וApo-מינ ', שבו ליגנד מחייב מביא שני fluorophores במגע קרוב יותר (איור 1).
_content "> בעבודה זו, פרוטוקול שהוצג לבניית השחלה אוגר סינית (CHO) שורות תאים שconstitutively להביע FIBS למטבוליט, גלוקוז או גלוטמין. המתודולוגיה הוא הוקם עבור הכיול של החיישן in vivo כדי לאפשר כמותיים עתיד מדידות של ריכוז המטבוליט תאיים, כפי שהוצגו באיור 2. על בסיס זה, הריכוז תאיים של גלוקוז או גלוטמין ניתן לקבוע בתרביות תאים שייזונו אצווה CHO, שלשני חומרים מזינים נוספו בריכוזים גבוהים בתהליך. התוצאות להוכיח כי שימוש באות הניאון מהשקרים ואת עקומת הכיול שנבנה בעבר, בצורה מדויקת חיזוי של הריכוז תאיים הוא אפשרי, כפי שאושר על ידי assay אנזימטי עצמאי. שיטה זו מציעה יתרונות משמעותיים על פני טכנולוגיות אנליטיות הנוכחיות משום שהיא עלות נמוכה לא פולשנית, ומהיר, נותן אות של FIBS שיכול להיות יום שני בזמן אמתitored לאורך כל התרבות.Protocol
Representative Results
Discussion
FIBS לאפשר in vivo ו בquantitation באתרו של מולקולות מרכזיות, במקרה זה חומרים מזינים הגבלת צמיחה, הסרת אי ודאות הנובעת ממרווה ומיצוי שיטות. הממצאים מראים כי קיים מתאם טוב בין אות שקרים ואת הריכוזים תאיים בטווח של 1-5 מ"מ לגלוקוז ו0.3-2 מ"מ לגלוטמין. בתרבית תאים אצווה CHO…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לפרופ 'וולף פרומר (מכון קרנגי למדע, אוניברסיטת סטנפורד) לחביבות לתת לנו גלוקוז סריג פלסמיד וד"ר Uwe Ludewig (אוניברסיטת הוהנהיים) לחביבות אספקת גלוטמין סריג לבנות בוקטור ביטוי צמח pUTKan. א.ב. ממומן על ידי תכנית studentships עדיפות BBSRC ממוקדת. CK וKP שניהם נתמכים על ידי מלגות RCUK בBiopharmaceuticals עיבוד. CK גם מבקש להודות ביולוגי Lonza לתמיכה הכספית שלהם. המרכז לביולוגיה וחדשנות סינתטיות נתמך בנדיבות על ידי EPSRC.
Materials
| CHO-S Cells | Life Tecnologies | 11619-012 | Cell line will vary depending on the goals of the study |
| pCDNA4/TO vector | Life Tecnologies | ||
| TransIT-PRO Transfection Reagent | Mirus Bio | MIR 5700 | Transfections can be accomplished using any method suitable for the cell line under study |
| Zeocin | Invivogen | ||
| CD-CHO medium | Life Technologies | 10743-011 | Cell growth medium is dependent upon the cells under study |
| 100X HT Supplement | Life Technologies | 11067-030 | |
| L-Glutamine 200 mM (100X), Liquid | Life Technologies | 25030032 | |
| InfinitePRO 200 plate reader | Tecan | FLx800TBI | Any 96-well fluorescence plate reader that can access the required wavelengths can be substituted |
| Filters for plate reader | Tecan | 30000463 | |
| (520NM BW 10NM) | |||
| 30022786 | |||
| (430NM BW 35NM) | |||
| 30022787 | |||
| (465NM BW 35NM) | |||
| Maxiprep Plasmid Purification Kit | Qiagen | 12163 | Any suitable kit can be substituted |
| Amplex Red glucose/glucose oxidase assay kit | Invitrogen | A22189 | Any suitable kit can be substituted |
| EnzyChrom Glutamine Assay Kit | BioAssay systems | EOAC-100 | Any suitable kit can be substituted |
| Improved Neubauer haemocytometer | Fisher Scientific | MNK-420-010N | |
| Incubator | Nuaire | NU-5510E |
Riferimenti
- Moser, I., Jobst, G., Urban, G. A. Biosensor arrays for simultaneous measurement of glucose, lactate, glutamate, and glutamine. Biosens. Bioelectron. 17 (4), 297-302 (2002).
- Billingsley, K., et al. Fluorescent nano-optodes for glucose detection. Anal. Chem. 82 (9), 3707-3713 (2010).
- Dattelbaum, J. D., Lakowicz, J. R. Optical Determination of Glutamine Using a Genetically Engineered Protein. Anal. Biochem. 291 (1), 88-95 (2001).
- Kfouri, M., et al. Toward a miniaturized wireless fluorescence-based diagnostic imaging system. IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 14 (1), 226-234 (2008).
- Dittrich, P. S., Manz, A. Single-molecule fluorescence detection in microfluidic channels—the Holy Grail in muTAS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 382 (8), 1771-1782 (2005).
- Hou, B. H., Codamo, J., Pilbrough, W., Hughes, B., Gray, P. P., Munro, T. P. Optical sensors for monitoring dynamic changes of intracellular metabolite levels in mammalian cells. Nat. Protoc. 6 (7), 1818-1833 (2011).
- Bermejo, C., Haerizadeh, F., Takanaga, H., Chermak, D., Frommer, W. B. Dynamic analysis of cytosolic glucose and ATP levels in yeast using optical sensors. Biochem. J. 432, 399-406 (2010).
- Yang, H. Y., Bogner, M., Stierhof, Y. D., Ludewig, U. H(+)-independent glutamine transport in plant root tips. Plos One. 5, (2010).
- Fehr, M., Takanaga, H., Ehrhardt, D. W., Frommer, W. B. Evidence for high-cavacity bidirectional glucose transport across the endoplasmic reticulum membrane by genetically encoded fluorescence resonance energy transfer nanosensors. Mol. Cell. Biol. 25 (24), 11102-11112 (2005).
- Ai, H. W., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Fluorescent protein FRET pairs for ratiometric imaging of dual biosensors. Nat. Methods. 5 (5), 401-403 (2008).
- Ouyang, M. X., Sun, J., Chien, S., Wang, Y. X. Determination of hierarchical relationship of Src and Rac at subcellular locations with FRET biosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14353-14358 (2008).
- Han, Y., et al. Cultivation of recombinant Chinese hamster ovary cells grown as suspended aggregates in stirred vessels. J. Biosci. Bioeng. 102 (5), 430-435 (2006).
- Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering. Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).
- Wong, D. C. F., Wong, N. S. C., Goh, J. S. Y., May, L. M., Yap, M. G. S. Profiling of N-Glycosylation gene expression in CHO cell Fed-batch cultures. Biotechnol. Bioeng. 107 (2), 516-528 (2010).
- Behjousiar, A., Kontoravdi, C., Polizzi, K. M. In Situ Monitoring of Intracellular Glucose and Glutamine in CHO Cell Culture. PLoS One. 7, (2012).
- Dwyer, M. A., Hellinga, H. W. Periplasmic binding proteins: a versatile superfamily for protein engineering. Curr. Opin. Struct. Biol. 14 (4), 495-504 (2004).
