FIBS-aktiverade Noninvasive Metabolic Profiling
Summary
En beskrivning av hur man kalibrerar Förster Resonance Energy Transfer integrerade biologiska sensorer (FIBS) för in situ metabolisk profilering presenteras. De FIBS kan användas för mätning av intracellulära nivåer av metaboliter noninvasively medhjälp i utvecklingen av metaboliska modeller och högeffektiv screening av bioprocess betingelser.
Abstract
I en tid präglad av beräkningsbiologi, nya hög genomströmning experimentella system är nödvändiga för att befolka och förfina modeller så att de kan valideras för prognoser. Helst sådana system skulle vara låg volym, vilket utesluter provtagning och destruktiva analyser när tiden kursdata ska erhållas. Vad som behövs är en in situ-övervakning verktyg som kan rapportera nödvändig information i realtid och icke-invasivt. Ett intressant alternativ är att använda fluorescerande, proteinbaserade in vivo biologiska sensorer som föredragande av intracellulära koncentrationer. En särskild klass av in vivo biosensorer som har funnit tillämpningar inom metabolit kvantifiering är baserad på Förster Resonance Energy Transfer (FRET) mellan två fluorescerande proteiner som förbinds med en ligandbindningsdomän. FRET integrerade biologiska sensorer (FIBS) är konstitutivt produceras inom cellinje, de har snabba svarstider och deras spektrala chaskaper ändras baserat på koncentrationen av metabolit i cellen. I detta dokument är den metod för att konstruera kinesisk hamsterovarie (CHO)-cellinjer som konstitutivt uttrycker en FIBS för glukos och glutamin och kalibrera de FIBS in vivo i batch-cellkultur för att möjliggöra framtida kvantifiering av intracellulär metabolit koncentration beskrivas. Data från fed-batch-CHO-cellkulturer visar att de FIBS kunde i varje fall för att detektera den resulterande förändring i den intracellulära koncentrationen. Med hjälp av fluorescerande signalen från FIBS och den tidigare konstruerade kalibreringskurvan, var den intracellulära koncentrationen noggrant bestämmas vilket bekräftas av en oberoende enzymatisk analys.
Introduction
Metabolite övervakning har olika tillämpningar inom biobehandling, inklusive processutveckling, media och foder design och metabolisk teknik. Olika metoder finns tillgängliga för koncentrationsmätningar genom användning av enzymatisk 1, kemiska 2, eller bindningsanalyser 3. Ett intressant alternativ är att använda fluorescerande, proteinbaserade in vivo biologiska sensorer som reportrar i den intracellulära koncentrationen av viktiga metaboliter. I ultra-låg volym analyser är fluorescens ett praktiskt verktyg som miniatyrisering faktiskt förbättrar signal-till-brus-förhållande 4,5 och proteinbaserade sensorer kan genetiskt kodad börden att inga exogena reagens är nödvändiga för metabolitanalys. Förster resonance energy transfer (FRET) biosensorer bestå av två fluorescerande proteiner förbundna med en ligandbindande domän. FRET är en icke-strålande överföring av energi från en fotoexciterade donator till en acceptor fluorescerande molekyl lokali ed i omedelbar närhet (<100). Ligand klyvning eller bindning orsakar en konformationsförändring i sensorn, vilket i sin tur inducerar en förändring i närheten av de fluoroforer, vilket leder till en förändring i FRET-effektiviteten mätt med förändringen i emissionsspektrumet. FRET integrerade biologiska sensorer (FIBS) är konstitutivt produceras inom cellinje och deras spektrala egenskaper ändras beroende på koncentrationen av metaboliten i cellen. FIBS har snabba svarstider gör dem idealiska för att göra mätningar för dynamiska modeller 6. Tidigare användningsområden är övervakning enstaka 7-9 och multipla 10 metaboliter och tillhandahålla uppgifter om spatiotemporal fördelning 11. FIBS kan skapas i två konfigurationer: Apo-Max, där ligandbindningen stör närhet fluoroforema sänka energiöverföring och Apo-Min, där ligand bindning ger de två fluoroforerna i närmare kontakt (figur 1).
_content "> I detta arbete är ett protokoll som presenteras för att konstruera kinesisk hamster äggstock (CHO) cellinjer som konstitutivt uttrycker en FIBS för en metabolit, glukos eller glutamin. En metod är etablerad för kalibrering av sensorn in vivo för att möjliggöra framtida kvantitativa mätningar av intracellulär metabolit koncentration, enligt figur 2. Baserat på detta, den intracellulära koncentrationen av glukos eller glutamin kan bestämmas i fed-batch CHO cellkulturer, till vilken de två näringsämnen tillkom i höga koncentrationer i-process. Resultaten visa att du använder den fluorescerande signalen från FIBS och den tidigare konstruerade kalibreringskurvan, är möjligt att korrekt förutsägelse av den intracellulära koncentrationen, vilket bekräftas av en oberoende enzymatisk analys. Denna metod ger väsentliga fördelar jämfört med nuvarande analytiska tekniker eftersom det är icke-invasiv, billig och snabb, vilket ger en realtidssignal av de FIBS som kan vara månitored hela kulturen.Protocol
Representative Results
Discussion
De FIBS möjliggör in vivo och in situ kvantifiering av viktiga molekyler, i det här fallet tillväxtbegränsande näringsämnen, ta bort osäkerhet som härrör från släckning och utvinning metoder. Resultaten tyder på att det finns en god korrelation mellan FIBS signalen och de intracellulära koncentrationer i intervallet 1-5 mM för glukos och 0,3-2 mM för glutamin. I sats CHO cellodling, är dessa koncentrationer påträffas i exponentiella, stationära, och tidiga nedgång faserna. Den expo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar professor Wolf Frommer (Carnegie Institution for Science, Stanford University) för vänligt ger oss glukosen FRET plasmiden och Dr Uwe Ludewig (Hohenheim Universitet) för vänligt tillföra glutamin FRET konstruera i pUTKan växtexpressionsvektor. AB finansieras av BBSRC Riktade prioriterade doktorandprogram. Både CK och KP stöds av RCUK stipendier i Biopharmaceuticals Processing. CK vill även tacka Lonza Biologics för deras ekonomiska stöd. Centrum för syntetisk biologi och innovation är generöst stöd av EPSRC.
Materials
| CHO-S Cells | Life Tecnologies | 11619-012 | Cell line will vary depending on the goals of the study |
| pCDNA4/TO vector | Life Tecnologies | ||
| TransIT-PRO Transfection Reagent | Mirus Bio | MIR 5700 | Transfections can be accomplished using any method suitable for the cell line under study |
| Zeocin | Invivogen | ||
| CD-CHO medium | Life Technologies | 10743-011 | Cell growth medium is dependent upon the cells under study |
| 100X HT Supplement | Life Technologies | 11067-030 | |
| L-Glutamine 200 mM (100X), Liquid | Life Technologies | 25030032 | |
| InfinitePRO 200 plate reader | Tecan | FLx800TBI | Any 96-well fluorescence plate reader that can access the required wavelengths can be substituted |
| Filters for plate reader | Tecan | 30000463 | |
| (520NM BW 10NM) | |||
| 30022786 | |||
| (430NM BW 35NM) | |||
| 30022787 | |||
| (465NM BW 35NM) | |||
| Maxiprep Plasmid Purification Kit | Qiagen | 12163 | Any suitable kit can be substituted |
| Amplex Red glucose/glucose oxidase assay kit | Invitrogen | A22189 | Any suitable kit can be substituted |
| EnzyChrom Glutamine Assay Kit | BioAssay systems | EOAC-100 | Any suitable kit can be substituted |
| Improved Neubauer haemocytometer | Fisher Scientific | MNK-420-010N | |
| Incubator | Nuaire | NU-5510E |
Riferimenti
- Moser, I., Jobst, G., Urban, G. A. Biosensor arrays for simultaneous measurement of glucose, lactate, glutamate, and glutamine. Biosens. Bioelectron. 17 (4), 297-302 (2002).
- Billingsley, K., et al. Fluorescent nano-optodes for glucose detection. Anal. Chem. 82 (9), 3707-3713 (2010).
- Dattelbaum, J. D., Lakowicz, J. R. Optical Determination of Glutamine Using a Genetically Engineered Protein. Anal. Biochem. 291 (1), 88-95 (2001).
- Kfouri, M., et al. Toward a miniaturized wireless fluorescence-based diagnostic imaging system. IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 14 (1), 226-234 (2008).
- Dittrich, P. S., Manz, A. Single-molecule fluorescence detection in microfluidic channels—the Holy Grail in muTAS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 382 (8), 1771-1782 (2005).
- Hou, B. H., Codamo, J., Pilbrough, W., Hughes, B., Gray, P. P., Munro, T. P. Optical sensors for monitoring dynamic changes of intracellular metabolite levels in mammalian cells. Nat. Protoc. 6 (7), 1818-1833 (2011).
- Bermejo, C., Haerizadeh, F., Takanaga, H., Chermak, D., Frommer, W. B. Dynamic analysis of cytosolic glucose and ATP levels in yeast using optical sensors. Biochem. J. 432, 399-406 (2010).
- Yang, H. Y., Bogner, M., Stierhof, Y. D., Ludewig, U. H(+)-independent glutamine transport in plant root tips. Plos One. 5, (2010).
- Fehr, M., Takanaga, H., Ehrhardt, D. W., Frommer, W. B. Evidence for high-cavacity bidirectional glucose transport across the endoplasmic reticulum membrane by genetically encoded fluorescence resonance energy transfer nanosensors. Mol. Cell. Biol. 25 (24), 11102-11112 (2005).
- Ai, H. W., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Fluorescent protein FRET pairs for ratiometric imaging of dual biosensors. Nat. Methods. 5 (5), 401-403 (2008).
- Ouyang, M. X., Sun, J., Chien, S., Wang, Y. X. Determination of hierarchical relationship of Src and Rac at subcellular locations with FRET biosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14353-14358 (2008).
- Han, Y., et al. Cultivation of recombinant Chinese hamster ovary cells grown as suspended aggregates in stirred vessels. J. Biosci. Bioeng. 102 (5), 430-435 (2006).
- Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering. Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).
- Wong, D. C. F., Wong, N. S. C., Goh, J. S. Y., May, L. M., Yap, M. G. S. Profiling of N-Glycosylation gene expression in CHO cell Fed-batch cultures. Biotechnol. Bioeng. 107 (2), 516-528 (2010).
- Behjousiar, A., Kontoravdi, C., Polizzi, K. M. In Situ Monitoring of Intracellular Glucose and Glutamine in CHO Cell Culture. PLoS One. 7, (2012).
- Dwyer, M. A., Hellinga, H. W. Periplasmic binding proteins: a versatile superfamily for protein engineering. Curr. Opin. Struct. Biol. 14 (4), 495-504 (2004).
