Studie van fagolysosoom Biogenesis Live macrofagen
Abstract
Fagocyterende cellen spelen een belangrijke rol in het aangeboren immuunsysteem door het verwijderen en het elimineren van binnendringende micro-organismen in hun fagosomen. Phagosome rijping is de complexe en strak gereguleerd proces waarbij een ontluikende phagosome ondergaat drastische transformatie door middel van goed georkestreerde interacties met verschillende cellulaire organellen en compartimenten in het cytoplasma. Dit proces, dat essentieel is voor de fysiologische functie van fagocyten door begiftigt phagosomes hun lytische en bactericide eigenschappen, afgesloten met fusie van phagosomes met lysosomen en biogenese van phagolysosomes die wordt beschouwd als de laatste en kritieke fase van rijping voor phagosomes zijn. In dit rapport beschrijven we een live cell imaging gebaseerde methode voor de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van het dynamische proces van lysosoom om content delivery, dat is een kenmerk van fagolysosoom biogenese phagosome. Deze aanpak maakt gebruik van IgG-gecoate microbolletjes als model voor phagocytosis en fluorofoor-geconjugeerde dextran moleculen als een luminale lysosomale lading sonde, om de dynamische levering van lysosmal inhoud aan de phagosomes in real time in levende macrofagen te volgen met behulp van time-lapse imaging en confocale laser scanning microscopie. Hier beschrijven we in detail de achtergrond, de voorbereidende stappen en stap-voor-stap experimentele opstelling gemakkelijke en nauwkeurige plaatsing van deze methode in andere laboratoria mogelijk. De beschreven werkwijze is eenvoudig, robuust, en vooral kan gemakkelijk worden aangepast aan phagosomal interacties en rijping bestuderen verschillende systemen en onder verschillende experimentele opstellingen zoals het gebruik van verschillende typen fagocytische cellen, verlies-van-functie experimenten verschillende probes en fagocytische deeltjes.
Introduction
Professionele fagocyten, waaronder macrofagen, spelen een belangrijke in het immuunsysteem. Naast het feit dat de eerste lijn van defensie in het aangeboren immuunsysteem, ze een cruciale rol spelen bij de activering van de adaptieve immuniteit door hun signalering en antigeen-presenterende rol 1-3. Terwijl de functie van professionele fagocyten is veelzijdig, phagosome rijping is de kritische ruggengraat van de bacteriedodende en antigeenverwerking functie van de professionele fagocyten 4,5. Bij de receptor gemedieerde engulfment en opname van een fagocytaire doel, zoals bacteriën, de ontluikende phagosome gaat door een complexe en goed georkestreerde opeenvolging van interactie en uitwisseling met compartimenten van de endocytische netwerk en verscheidene andere celorganellen 6. De aard van de verbindingen uitgewisseld met deze cellulaire entiteiten evenals de verordening en de timing van de fusie gebeurtenissen bepaalt de luminale phagosomal milieu en de phagosomal membraansamenstelling en dus 7, het lot van de rijping phagosome 8.
De fysiologische relevantie van phagosome rijping wordt geïllustreerd door de verschillende strategieën die door diverse intracellulaire pathogenen om te ontsnappen aan, arrestatie of ondermijnen phagosome rijping 9. De meeste strategieën rechtstreeks verhinderen de laatste en kritieke fase van phagosome rijpingsproces: de fusie van phagosome met late endosomale / lysosomale compartimenten, die hen begiftigt met het grootste deel van de hydrolytische enzymen en antibacteriële factoren van een volwassen phagosome 7 , 8,10. Analyse van deze laatste en cruciale stap daarom kan ons sterke indicatoren over de staat van rijping van de phagosomes en als de natuurlijke fysiologische toestand wordt positief of negatief beïnvloed onder de specifieke experimentele instellingen die worden gebruikt.
De late endosomale / lysosomale compartiments worden algemeen beschouwd de terminal compartimenten van de endocytische route, bepaald en onderscheiden van de vroege endocytische compartimenten door de aanwezigheid van verschillende, fase specifieke marker moleculen. Bijvoorbeeld hydrolytische enzymen of membraan componenten zoals Lysosomal geassocieerd membraaneiwitten (lampen) onder anderen 11. De terminal endocytisch compartimenten-voortaan kortweg lysosomen-ook dienen als de belangrijkste locatie voor de laatste fasen van de spijsvertering aan het einde van de fagocytaire / endocytische route 12. Zo kan verteerbare sondes door endocytose en macropinocytose het extracellulaire milieu geladen en getransporteerd door de endocytische route naar lysosomen, waar het zich ophoopt 13,14 na na een bepaalde cyclus van opname en jacht. Fluorofoor geconjugeerde probes voor fluorescentiemicroscopie zoals organische verteerbare polymeer dextran worden vaak gebruikt als endocyticprobes 15-17.
<p class = "jove_content"> In deze werkwijze beschrijven we het gebruik van IgG-beklede microkorrels als fagocytische lading phagosome rijping onderzocht door analyse van de afgifte van lysosomale luminale inhoud phagosomes. Door het gebruik van een fluorofoor-geconjugeerde dextran sonde als een gemakkelijk detecteerbare merker van lysosomen in levende beenmerg afgeleide macrofagen (BMM) en time-lapse video beeldvorming met een confocale laser scanning microscoop, volgen we het dynamische proces van lading levering in fagosomen met hoge temporele resolutie. Vervolgens beschrijven we hoe de verzamelde time-lapse imaging data kan worden geëvalueerd met behulp van de open-source en vrij beschikbare software voor beeldanalyse, Fiji (of ImageJ), statistisch geanalyseerd met behulp van Microsoft Excel en gepresenteerd met behulp van GraphPad Prism software 14,18.Na de beschrijving van onze werkwijze kunnen analoge experimenten ontworpen met gewijzigde instellingen factoren en hun invloed op phagosome rijping onderzoeken; vrijwel elke othaar type hechtende primaire of cellijn fagocytcellen, genetische verlies van functie experimenten, inclusief gen knock-out en knock-down, mutanten of expressie van fusie-eiwitten, fagocytaire-doelstellingen, microbead deklaagmengelingen, endosomale / lysosomale sondes en factoren zoals een cytokines, chemische inhibitoren of siRNA onder andere variabelen zijn die kunnen worden toegepast op de basisbenadering van deze methode.
We definiëren het doel en de fundamentele eisen van deze methode als volgt:
- Doel van de methode: de directe, kwantitatieve en kwalitatieve observatie en analyse van phagosome rijping met een hoge temporele resolutie in levende fagocytcellen schakelen.
- Fagocytische lading: Een ter zake gecoat microdeeltjes of biologische doel. Hier gebruiken we IgG-coated 3 micrometer sferische polystyreen microdeeltjes die gemakkelijk worden geïnternaliseerd via de Fc-γ receptor gemedieerde fagocytose. Als alternatief kan elk micro-organisme of gecoat microparticle waarvoor fagocytische receptor aanwezig is op de cellen kan worden gebruikt.
- Fagocyten: Hechtende fagocytische cellen die de juiste fagocytische receptoren. Hier gebruiken we de muis primaire BMMs die overvloedig de Fc-γ receptoren. Als alternatief zou dendritische cellen (DC), monocyten of fagocytaire epitheelcellen of hun genetische mutanten of knock-out varianten worden gebruikt.
- Lysosomale lading: Een fluorescent gelabelde lysosomale probe. Hier is Texas Red-geconjugeerd 70.000 kiloDalton dextran (Dex70kD) als het luminale lading van de lysosomen. Als alternatief kan elk fluorescent detecteerbare merker of een cellulair compartiment of organel, of een geschikte probe voor phagosomal eigenschappen zoals zuurgraad of afbrekende capaciteit kan worden gebruikt om de progressie van phagosome rijping bestuderen.
- Beïnvloedende factoren: bijvoorbeeld signaalmoleculen, chemische verbindingen, gen knock-down, of transiënte expressie van mutante eiwitten kon. Hier hebben we Förgeen het gebruik van een dergelijke factor voor de eenvoud maar een recent voorbeeld met mutant eiwitexpressie en neerhalen invloedsfactoren zie Kasmapour et al.. 18 Elke factor die invloed fagocytose of de omstandigheden en mobiliteit van phagosomes en / of de compartimenten die interageren met rijping phagosomes zou kunnen worden gebruikt.
Protocol
Representative Results
Discussion
In de volgende paragraaf zullen we bespreken kritische stappen van de gepresenteerde methode en zijn beperkingen. Verder zullen we verbinden een aantal van de meest voorkomende problemen met hun oplossingen, mogelijk wijzigingen aan te brengen en te overwegen de voordelen van onze methode alsmede geschikte complementaire methoden voor deze aanpak.
De bereiding van de korrels, zoals de koppeling van IgG aan de korrel oppervlak is cruciaal en het gebruik van unfresh preparaten worden vermeden….
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de leden van de phagosome Biology Laboratory voor het kritisch lezen van het manuscript. Dit werk wordt ondersteund door een Helmholtz Young Investigator Grant (Initiative en Netwerken fondsen van de Helmholtz Association) en een Prioriteit Programma SPP1580 Grant van de Duitse Research Council (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagles Medium (D-MEM) | PAA, Austria | E15-009 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium without phenol red (D-MEM) | PAA, Austria | E15-047 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA, Austria | A15-151 | |
| L-Glutamine | PAA, Austria | M11-004 | |
| PBS | PAA, Austria | H15-002 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA, Austria | P11-010 | |
| WillCo-dish® Glass bottom dish (35 mm ∅, #1.5) | WillCo Wells, Netherlands | GWSt-3522 | |
| CELLviewTM glass bottom dish, 35 mm | Greiner Bio one, Germany | 627871 | Alternative: Available as segmented |
| Carboxylated latex microspheres | Polysciences, USA | #09850 | Available in different diameters, we used 3 μm |
| Polystyrene microparticles | Kisker Biotech, Germany | PPs-3.0COOH | |
| Triton-X 100 | ROTH, Germany | 305.1.3 | |
| mouse whole IgG | Rockland, USA | 010-0102 | |
| EDAC crosslinker | Sigma-Aldrich, USA | E6383-1g | |
| 10 mM Tris | Sigma-Aldrich,USA | T1503 | |
| 1-ml syringe Omnifix -F | B.Braun, Germany | 9161406V | |
| 26 G needle (0.45*25 mm) | B.Baun, Germany | 4657683 | |
| RPMI 1640 | PAA, Austria | E15-039 | |
| Horse Serum | Gibco, USA | 16050-122 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich, USA | M2933 | |
| 0.2 μM syringe mounted filter | Sartorius, Germany | 83.1826.001 |
Riferimenti
- Greenberg, S., Grinstein, S. Phagocytosis and innate immunity. Curr. Opin. Immunol. 14, 136-145 (2002).
- Jutras, I., Desjardins, M. Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 511-527 (2005).
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science. 327, 291-295 (2010).
- Stuart, L., Ezekowitz, R. Phagocytosis: elegant complexity. Immunity. 22, 539-550 (2005).
- Blander, J. M., Medzhitov, R. On regulation of phagosome maturation and antigen presentation. Nat. Immunol. 7, 1029-1035 (2006).
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu. Rev. Pathol. 7, 61-98 (2012).
- Vieira, O. V., Botelho, R. J., Grinstein, S. Phagosome maturation: aging gracefully. Biochem. J. 366, 689-704 (2002).
- Haas, A. The phagosome: compartment with a license to kill. Traffic. 8, 311-330 (2007).
- Flannagan, R. S., Cosio, G., Grinstein, S. Antimicrobial mechanisms of phagocytes and bacterial evasion strategies. Nat Rev Microbiol. 7, 355-366 (2009).
- Luzio, J., Pryor, P., Bright, N. Lysosomes: fusion and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 622-632 (2007).
- Huotari, J., Helenius, A. Endosome maturation. EMBO J. 30, 3481-3500 (2011).
- Luzio, J. P., et al. Lysosome-endosome fusion and lysosome biogenesis. J. Cell. Sci. 113 (pt 9), 1515-1524 (2000).
- Eissenberg, L., Goldman, W. Fusion of lysosomes with phagosomes containing Histoplasma capsulatum: use of fluoresceinated dextran). Adv. Exp. Med. Biol. 239, 53-61 (1988).
- de Souza Carvalho, C., et al. Internalization, phagolysosomal biogenesis and killing of mycobacteria in enucleated epithelial cells. Cell. Microbiol. 13, 1234-1249 (2011).
- Wang, Y. L. Differential and sequential delivery of fluorescent lysosomal probes into phagosomes in mouse peritoneal macrophages. J. Cell Biol. 104, 1749-1754 (1987).
- Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. Phagosomes Fuse with Late Endosomes and/or Lysosomes by Extension of Membrane Protrusions along Microtubules: Role of Rab7 and RILP. Mol. Cell. Biol. 23, 6494-6506 (2003).
- Huynh, K. K., et al. LAMP proteins are required for fusion of lysosomes with phagosomes. EMBO J. 26, 313-324 (2007).
- Kasmapour, B., Gronow, A., Bleck, C., Hong, W., Gutierrez, M. Size-dependent mechanism of cargo sorting during lysosome-phagosome fusion is controlled by Rab34. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 20485-20490 (2012).
- Snijder, B., et al. Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection. Nature. 461, 520-523 (2009).
- Knight, M., Roberts, S., Lee, D., Bader, D. Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284, 9 (2003).
- Hemmi, H., et al. A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA. Nature. 408, 740-745 (2000).
- Underhill, D., Ozinsky, A. Toll-like receptors: key mediators of microbe detection. Curr. Opin. Immunol. 14, 103-110 (2002).
- Bohdanowicz, M., Cosío, G., Backer, J., Grinstein, S. Class I and class III phosphoinositide 3-kinases are required for actin polymerization that propels phagosomes. J. Cell Biol. 191, 999-1012 (2010).
- Hoffmann, E., et al. Initial receptor-ligand interactions modulate gene expression and phagosomal properties during both early and late stages of phagocytosis. Eur. J. Cell Biol. 89, 693-704 (2010).
- Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. The kinetics of phagosome maturation as a function of phagosome/lysosome fusion and acquisition of hydrolytic activity. Traffic. 6, 413-420 (2005).
- Savina, A., et al. NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells. Cell. 126, 205-218 (2006).
- Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. Recording phagosome maturation through the real-time, spectrofluorometric measurement of hydrolytic activities. Methods Mol. Biol. 531, 157-171 (2009).
- Russell, D., Vanderven, B., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function. Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).
- Hoffmann, E., et al. Autonomous phagosomal degradation and antigen presentation in dendritic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14556-14561 (2012).
- Tan, S., Sukumar, N., Abramovitch, R., Parish, T., Russell, D. Mycobacterium tuberculosis Responds to Chloride and pH as Synergistic Cues to the Immune Status of its Host Cell. PLoS Pathog. 9, (2013).
- Aziz, M., Yang, W. -. L., Wang, P., Coliganet, J. E. Measurement of phagocytic engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Current protocols in immunology. 14, (2013).
- Rogers, L., Foster, L. The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 18520-18525 (2007).
- Russell, D. G., Vanderven, B. C., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. S. The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function. Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).
- Savina, A., Vargas, P., Guermonprez, P., Lennon, A. -. M., Amigorena, S. Measuring pH, ROS production, maturation, and degradation in dendritic cell phagosomes using cytofluorometry-based assays. Methods. Mol. Biol. 595, 383-402 (2010).
