Étude de phagolysosome biogenèse dans les macrophages en direct

Published: March 10, 2014
doi:

Abstract

Les cellules phagocytaires jouent un rôle majeur dans le système immunitaire inné en enlevant et en éliminant les micro-organismes envahisseurs dans leurs phagosomes. Phagosome maturation est le processus complexe et étroitement réglementé au cours de laquelle un phagosome naissant subit une transformation radicale par des interactions bien orchestrées avec divers organites cellulaires et des compartiments dans le cytoplasme. Ce processus, qui est essentiel pour la fonction physiologique des cellules phagocytaires en dotant phagosomes avec leurs propriétés lytiques et bactéricides, culmine dans la fusion des phagosomes avec les lysosomes et la biogenèse des phagolysosomes qui est considéré comme la dernière étape critique de la maturation pour phagosomes. Dans ce rapport, nous décrivons une méthode basée imagerie des cellules vivantes pour l'analyse qualitative et quantitative de la dynamique de lysosome pour phagosome livraison de contenu, ce qui est une caractéristique de phagolysosome biogenèse. Cette approche utilise des microbilles recouvertes d'IgG comme un modèle pour phagocytose et molécules de dextran fluorophore conjugué comme sonde de fret lysosomale luminale, afin de suivre la livraison de contenu dynamique de lysosmal aux phagosomes en temps réel dans les macrophages vivants en utilisant l'imagerie time-lapse et la microscopie confocale à balayage laser. Ici, nous décrivons en détail l'arrière-plan, les étapes de préparation et de la mise en place, étape par étape expérimentale pour permettre un déploiement facile et précis de ce procédé à d'autres laboratoires. Notre méthode décrite est simple, robuste, et surtout, peuvent être facilement adaptés à l'étude des interactions phagosome et la maturation dans les différents systèmes et sous divers paramètres expérimentaux tels que l'utilisation de différents types de cellules phagocytaires, des expériences de perte de fonction, différentes sondes, et particules phagocytaires.

Introduction

Phagocytes professionnels, y compris les macrophages, joue un crucial dans le système immunitaire. En plus d'être la première ligne de défense du système immunitaire inné, ils jouent également un rôle essentiel dans l'activation de l'immunité adaptative par leur signalisation et présentant l'antigène rôle 1-3. Bien que la fonction des phagocytes professionnels est à multiples facettes, phagosome maturation est l'épine dorsale critique de la fonction de traitement bactéricide et l'antigène des phagocytes professionnels 4,5. Lors de l'immersion et de l'absorption d'une cible phagocytaires, tels que des bactéries médiée par le récepteur, le phagosome naissante passe par une séquence complexe et bien orchestrée de l'interaction et des échanges avec des compartiments du réseau d'endocytose et plusieurs autres organites cellulaires 6. La nature des composés échangé avec ces entités cellulaires ainsi que la réglementation et le calendrier des événements de fusion détermine la luminale phagosome milieu et les phagoscomposition de omal de membrane et donc 7, le sort du phagosome échéant le 8.

La pertinence physiologique de maturation du phagosome est illustré par les diverses stratégies employées par les différents agents pathogènes intracellulaires d'échapper, arrêter ou renverser phagosome maturation 9. La plupart de ces stratégies prévenir directement ou indirectement la phase finale et critique du processus de maturation du phagosome: la fusion de phagosome avec des compartiments fin endosomal / lysosomales, qui leur apporte l'essentiel des enzymes hydrolytiques et des facteurs anti-bactériennes du phagosome maturité 7 , 8,10. L'analyse de cette étape finale et critique peut donc nous fournir des indicateurs solides sur l'état de maturation des phagosomes et si l'état physiologique naturel est d'être positivement ou négativement affecté dans les paramètres expérimentaux particuliers qui sont utilisés.

Le compartiment endosomes tardifs / lysosomess sont généralement considérés comme les compartiments de raccordement de la voie d'endocytose, définis et distingués des compartiments d'endocytose début par la présence de divers, en scène, des molécules spécifiques de marqueurs. Par exemple des enzymes hydrolytiques ou composants de la membrane telles que les protéines de la membrane lysosomale associés (lampes) entre autres 11. Le terminal endocytose compartiments-appelée simplement comme lysosomes-servent également de l'emplacement principal pour les phases finales de la digestion à la fin de la voie de phagocytose / 12 endocytose. De cette manière, des sondes non digestibles peuvent être chargés par l'intermédiaire de l'endocytose et macropinocytose le milieu extracellulaire et transportés à travers la voie d'endocytose vers les lysosomes, où il s'accumule 13,14 après avoir suivi un cycle défini de l'absorption et de chasse. sondes conjugué à un fluorophore pour la microscopie fluorescente telle que le dextrane polymère organique non digestible sont couramment utilisés comme endocyticprobes 15-17.

<p class = "jove_content"> Dans cette méthode, nous décrivons l'utilisation de microbilles recouvertes d'IgG en tant que cargaison phagocytaire d'enquêter phagosome maturation par l'analyse de la livraison de contenu lysosomale luminale de phagosomes. En utilisant une sonde dextran conjugué à un fluorophore comme un marqueur facilement détectable des lysosomes dans les macrophages os vivant de moelle dérivés (BMM) et vidéo en temps réel l'imagerie avec un microscope confocal à balayage laser microscope, nous suivons le processus dynamique de la livraison de marchandises en phagosomes à haute résolution temporelle. Nous décrivons ensuite comment les données d'imagerie time-lapse collectées peuvent être évaluées en utilisant open-source et disponible gratuitement le logiciel d'analyse d'image, Fidji (ou ImageJ), une analyse statistique en utilisant Microsoft Excel et présenté en utilisant le logiciel GraphPad Prism 14,18.

Après la description de notre méthode, des expériences analogues peuvent être conçus en utilisant les paramètres et les facteurs modifiés pour étudier leur influence sur la maturation du phagosome, pratiquement n'importe quel otson type de cellules phagocytaires primaires ou de lignées cellulaires adhérentes, perte génétique des expériences de fonction incluant le gène knock-out et knock-down, mutants ou l'expression de protéines de fusion, phagocytaires-cibles, les produits de revêtement de microbilles, des sondes endosomal / lysosomal et des facteurs comme une cytokines, des inhibiteurs chimiques ou siRNA entre autres, sont autant de variables qui peuvent être appliqués à l'approche de base de cette méthode.

Nous définissons l'objectif et les exigences de base de cette méthode comme suit:

  • Objectif de la méthode: pour permettre l'observation directe, quantitative et qualitative et l'analyse de la maturation du phagosome avec une haute résolution temporelle dans les cellules phagocytaires vivre.
  • Cargaison phagocytaire: une microparticule revêtue de manière appropriée ou d'une cible biologique. Ici, nous utilisons recouvertes d'IgG 3 um microparticules sphériques de polystyrène qui sont facilement internalisées via le récepteur Fc-γ phagocytose médiée. Sinon, tout micro-organisme ou micro revêturoparticle pour lequel un récepteur phagocytaire est présent sur les cellules peut être utilisé.
  • Les cellules phagocytaires: les cellules phagocytaires adhérentes exprimant les récepteurs phagocytaires appropriées. Ici, nous utilisons primaires BMMS de souris qui expriment les récepteurs Fc abondamment-γ. En variante, les cellules dendritiques (DC), les monocytes ou les cellules épithéliales phagocytaires ou à leurs mutants ou variants génétiques knock-out peuvent être utilisés.
  • Lysosomale cargaison: Une sonde lysosomale marqué par fluorescence. Ici, le Texas Red-conjugué 70,000 kiloDaltons dextran (Dex70kD) est utilisé en tant que la cargaison de luminal des lysosomes. En variante, n'importe quel marqueur détectable par fluorescence d'un compartiment cellulaire ou organite, ou une sonde appropriée pour les propriétés de phagosome tels que l'acidité ou la capacité de dégradation, peut être utilisée pour étudier la progression de la maturation phagosome.
  • Les facteurs d'influence: Par exemple, les molécules, les composés chimiques, gène knock-down, ou l'expression transitoire de protéines mutantes pourraient signalisation. Ici, nous avons FÖRGun l'utilisation d'un tel facteur pour des raisons de simplicité, mais pour un exemple récent avec l'expression de la protéine mutante et knock-down facteurs influençant s'il vous plaît voir Kasmapour et al. 18 Tout facteur qui peut affecter la phagocytose ou les circonstances et la mobilité des phagosomes et / ou les compartiments qui interagissent avec les phagosomes échéance pourraient être utilisés.

Protocol

Les soins aux animaux et toutes les procédures dans ce protocole respectent les lignes directrices nationales et institutionnelles. Préparer les préparations qui sont indiqués par «Π» au préalable. Une. Préparation de BMMS Effectuer l'abattage de la souris par dislocation cervicale. Retirer fémur et des os du tibia, les os gratuits à partir de tissu et couper les deux extrémités de l'accessibilité de la moelle osseuse. <…

Representative Results

La préparation correcte des cellules et les billes pour l'imagerie est critique. Figure 1 montre le contour de l'ensemencement, la sonde de chargement et les étapes de formation d'image initiaux dans ce procédé, sur la base de notre protocole optimisé pour BMMS. Il est donc essentiel que les paramètres de protocole être testées et optimisées en fonction du type de cellules et des sondes qui doivent être utilisés. Après addition des billes recouvertes …

Discussion

Dans la section suivante, nous allons discuter des étapes critiques de la méthode présentée et de ses limites. En outre, nous allons connecter certains des problèmes communs avec leurs solutions, apporter des modifications possibles et considérer les avantages de notre méthode ainsi que les méthodes complémentaires appropriés pour cette approche.

La préparation des billes, y compris le couplage de l'IgG à la surface des billes, est essentielle et l'utilisation de prépara…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions les membres du Laboratoire de Biologie Phagosome pour la lecture critique du manuscrit. Ce travail est soutenu par une subvention de Helmholtz Young Investigator (Initiative et les fonds de mise en réseau de l'Association Helmholtz) et un programme de priorité SPP1580 Grant du Conseil de recherches en allemand (Deutsche Forschungsgemeinschaft).

Materials

Dulbecco's Modified Eagles Medium (D-MEM) PAA, Austria E15-009
Dulbecco's Modified Eagles Medium without phenol red (D-MEM) PAA, Austria E15-047
Fetal Bovine Serum (FBS) PAA, Austria A15-151
L-Glutamine PAA, Austria M11-004
PBS PAA, Austria H15-002
Penicillin/Streptomycin PAA, Austria P11-010
WillCo-dish® Glass bottom dish (35 mm ∅, #1.5) WillCo Wells, Netherlands GWSt-3522
CELLviewTM glass bottom dish, 35 mm Greiner Bio one, Germany 627871 Alternative: Available as segmented
Carboxylated latex microspheres Polysciences, USA #09850 Available in different diameters, we used 3 μm
Polystyrene microparticles Kisker Biotech, Germany PPs-3.0COOH
Triton-X 100 ROTH, Germany 305.1.3
mouse whole IgG Rockland, USA 010-0102
EDAC crosslinker Sigma-Aldrich, USA E6383-1g
10 mM Tris Sigma-Aldrich,USA T1503
1-ml syringe Omnifix -F B.Braun, Germany 9161406V
26 G needle (0.45*25 mm) B.Baun, Germany 4657683
RPMI 1640 PAA, Austria E15-039
Horse Serum Gibco, USA 16050-122
MES hydrate Sigma-Aldrich, USA M2933
0.2 μM syringe mounted filter Sartorius, Germany 83.1826.001

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Citazione di questo articolo
Bronietzki, M., Kasmapour, B., Gutierrez, M. G. Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages. J. Vis. Exp. (85), e51201, doi:10.3791/51201 (2014).

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