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Articolo metodologico

Studio di fagolisosoma Biogenesis nei macrofagi in diretta

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⸱

DOI:

10.3791/51201

⸱

10 marzo 2014

 ,  , 
1Research Group Phagosome Biology, Helmholtz Centre for Infection Research, 2Division of Mycobacterial Research, National Institute for Medical Research

In questo articolo

Abstract

Fagociti giocano un ruolo importante nel sistema immunitario innato rimuovendo ed eliminando microrganismi invasori nelle loro fagosomi. Phagosome maturazione è un processo complesso e strettamente regolata durante la quale un phagosome nascente subisce drastica trasformazione attraverso le interazioni ben orchestrate, con vari organuli cellulari e scomparti nel citoplasma. Questo processo, che è essenziale per la funzione fisiologica di fagociti dotando phagosomes con le loro proprietà litici e battericide, culmina nella fusione di phagosomes con i lisosomi e biogenesi dei phagolysosomes che è considerato come l'ultimo e fondamentale fase di maturazione per phagosomes. In questo rapporto, descriviamo un metodo basato imaging cellulare dal vivo per l'analisi qualitativa e quantitativa del processo dinamico di lisosomi per phagosome fornitura di contenuti, che è una caratteristica di fagolisosoma biogenesi. Questo approccio utilizza microsfere IgG rivestite come modello per phagocytosis e molecole di destrano fluoroforo coniugato come sonda carico lisosomiale luminale, per seguire la consegna di contenuto dinamico lysosmal ai fagosomi in tempo reale in macrofagi vivi usando time-lapse imaging e microscopia confocale. Qui si descrive nel dettaglio sullo sfondo, le fasi di preparazione e la configurazione step-by-step sperimentale per consentire la distribuzione facile e precisa di questo metodo in altri laboratori. Il nostro metodo descritto è semplice, robusta e, soprattutto, può essere facilmente adattato per studiare le interazioni phagosomal e maturazione in sistemi diversi e in varie impostazioni sperimentali, come l'uso di vari tipi di fagociti, la perdita di funzione esperimenti, diverse sonde, e particelle fagociti.

Introduzione

Fagociti professionali, tra macrofagi, svolgono un fondamentale nel sistema immunitario. Oltre ad essere la prima linea di difesa del sistema immunitario innato, ma anche svolgere un ruolo critico nella attivazione della immunità adattativa attraverso la loro segnalazione e presentanti l'antigene ruolo 1-3. Mentre la funzione dei fagociti professionali è multiforme, phagosome maturazione è la spina dorsale critico della funzione di elaborazione battericida ed antigene dei fagociti professionali 4,5. Su engulfment recettore mediata e l'assorbimento di un bersaglio fagocitaria, come batteri, phagosome nascente passa attraverso una sequenza complessa ed armonico di interazione e scambi con compartimenti della rete endocitosi e diversi altri organelli cellulari 6. La natura dei composti scambiate con queste entità cellulari, nonché il regolamento e la tempistica degli eventi di fusione determina il phagosomal milieu luminale e le phagoscomposizione OMAL membrana e, quindi 7, il destino del phagosome maturazione 8.

La rilevanza fisiologica di phagosome maturazione è esemplificata dalle diverse strategie utilizzate dai vari agenti patogeni intracellulari di sfuggire, arresto o sovvertire phagosome maturazione 9. La maggior parte di queste strategie impediscono direttamente o indirettamente, la fase finale e critica del processo di maturazione phagosome: la fusione di phagosome con scomparti fine endosomal / lisosomiali, che conferisce loro la maggior parte degli enzimi idrolitici e fattori anti-batterici di un phagosome maturo 7 , 8,10. Analisi di questo passaggio finale e critico quindi ci può fornire con forti indicatori sullo stato di maturazione dei fagosomi e se lo stato fisiologico è essere positivamente o negativamente colpito sotto le impostazioni sperimentali particolari che vengono utilizzati.

Il vano tardi endosomal / lisosomiales sono generalmente considerati essere i compartimenti terminali della via endocitosi, definiti e distinti dai primi compartimenti endocitici dalla presenza di vari, determinata fase, molecole marcatori. Per esempio enzimi idrolitici o componenti di membrana quali le proteine ​​di membrana lisosomiale associata (lampade) tra gli altri 11. Il terminale endocitica compartimenti-d'ora in poi indicato semplicemente come lisosomi-servono anche come location principale per le fasi finali della digestione, alla fine della fagocitosi / endocytic percorso 12. In questo modo, non digeribili sonde possono essere caricati tramite endocitosi e macropinocitosi dall'ambiente extracellulare e trasportati attraverso la via endocytic ai lisosomi, dove si accumula 13,14 dopo aver seguito un determinato ciclo di assorbimento e inseguimento. Sonde fluoroforo coniugato per la microscopia a fluorescenza come il destrano polimero organico nondigestible sono comunemente usati come endocyticprobes 15-17.

In questo metodo, si descrive l'utilizzo di microsfere IgG rivestite come carico fagocitica indagare phagosome maturazione analizzando la consegna di lisosomiale contenuto luminale a phagosomes. Utilizzando una sonda destrano fluoroforo coniugato come marcatore facilmente rilevabile dei lisosomi nel midollo osseo dal vivo macrofagi derivati ​​(BMM) e time-lapse video di imaging con un microscopio confocale a scansione laser, seguiamo il processo dinamico di consegna del carico in phagosomes con elevata risoluzione temporale. Abbiamo poi descrive come i dati di imaging time-lapse raccolti possono essere valutate utilizzando l'open-source e software di analisi dell'immagine liberamente disponibile, Fiji (o ImageJ), statisticamente analizzati utilizzando Microsoft Excel e presentata utilizzando il software GraphPad Prism 14,18.

Dopo la descrizione del nostro metodo, esperimenti analoghi possono essere progettati utilizzando le impostazioni modificate e fattori di indagare la loro influenza sulla phagosome maturazione; qualsiasi otil suo tipo di fagociti primarie o linee cellulari aderenti, la perdita genetica degli esperimenti funzionali, tra cui gene knock-out e knock-down, mutanti o espressione delle proteine ​​di fusione, fagocitosi-obiettivi, composti di rivestimento microbead, sonde endosomal / lisosomiali e fattori quali una citochine, inibitori chimici o siRNA tra gli altri sono tutte variabili che possono essere applicate per l'approccio di base di questo metodo.

Definiamo l'obiettivo e requisiti di base di questo metodo come segue:

  • Obiettivo del metodo: per consentire l'osservazione diretta, quantitativa e qualitativa e l'analisi di phagosome maturazione con alta risoluzione temporale nel vivere fagociti.
  • Carico dei fagociti: Un microparticelle opportunamente rivestiti o bersaglio biologico. Qui usiamo IgG-rivestito 3 micron microparticelle sferiche di polistirolo che sono prontamente interiorizzati attraverso il recettore Fc-γ fagocitosi mediata. In alternativa, qualsiasi microrganismo o un microfono patinataroparticle per i quali è presente un recettore fagocitica delle cellule può essere utilizzato.
  • Fagociti: fagociti aderenti esprimono gli appropriati recettori fagociti. Qui usiamo il mouse BMMs primari abbondantemente esprimono i recettori Fc-γ. In alternativa, potrebbero essere utilizzati cellule dendritiche (DC), monociti o cellule epiteliali fagocitarie o loro mutanti o varianti genetiche knock-out.
  • Lisosomiali cargo: Una sonda lisosomiale fluorescente. Qui, Texas Red-coniugato 70.000 kDa destrano (Dex70kD) è usato come il carico luminale dei lisosomi. In alternativa, qualsiasi marcatore fluorescente rilevabile di un compartimento cellulare o organello, o una sonda appropriata per le proprietà phagosomal come acidità o degradativa capacità, potrebbe essere utilizzata per studiare la progressione della phagosome maturazione.
  • Fattori che influenzano: Ad esempio, molecole di segnalazione, composti chimici, gene knock-down, o espressione transiente di proteine ​​mutanti potrebbe. Qui, abbiamo Förguno l'uso di tale fattore per semplicità, ma per un esempio recente con l'espressione della proteina mutante e di knock-down fattori che influenzano Si prega di vedere Kasmapour et al. 18 Qualsiasi fattore che può influenzare la fagocitosi o le circostanze e la mobilità dei phagosomes e / o compartimenti che interagiscono con phagosomes scadenza potrebbero essere utilizzati.

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Protocollo

Cura degli animali e di tutte le procedure in questo protocollo seguono le linee guida istituzionali e nazionali.

Preparare i preparativi che sono indicati da "Π-" in anticipo.

1. Preparazione di BMMs

  1. Eseguire l'abbattimento dei topi da dislocazione cervicale.
  2. Rimuovere femore e tibia ossa, ossa liberi dal tessuto e tagliare le due estremità per l'accessibilità del midollo osseo.
  3. Mantenere ossa in PBS freddo o medio DMEM ghiacciata (integrato con 100 U / ml di penicillina e 100 pg / ml streptomicina, su ghiaccio fino alla fase successiva.
    Nota: Eseguire i seguenti passi sotto un armadio biosicurezza di classe II per ridurre al minimo il rischio di contaminazione.
  4. Lavare la cavità midollare con PBS freddo + penicillina / streptomicina utilizzando un 26 g (0,45 mm) ago attaccato ad una siringa da 1 ml.
  5. Cellule pellet per gentile centrifugazione a 350 xg per 10 min, risospendere il pellet in med BMMIUM e piatto in microbiologia sterile noncoated piastre di Petri.
    1. Preparazione del mezzo BMM
      • Modified Eagles medio DMEM Dulbecco
      • 10% FCS inattivato
      • 20% di fibroblasti di topo linea cellulare L929 cultura surnatante (fonte di macrofagi fattore stimolante le colonie, M-CSF)
      • Siero di cavallo al 5%
      • 2 mM glutammina
    2. Preparazione della linea cellulare L929 mezzo di coltura;
      • RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640
      • 10% FCS inattivato
      • 2 mM glutammina
    3. Preparazione di fibroblasti di topo L929 linea cellulare supernatante di coltura;
      • Cellule confluenti L929 sono stati suddivisi 1:4, colta nel 175 cm 2 palloni per 2 giorni utilizzando 20 ml L929 medio e il supernatante di coltura è stato raccolto dopo 48 ore, filtrati e aggiunti al BMM medio
  6. Incubare le cellule arrossate dalfemore in un incubatore a 37 ° C in 5% CO 2 nell'atmosfera.
  7. Dopo ogni 48 ore (massimo 72 ore) di incubazione, aspirare il terreno e sostituirlo con fresco mezzo BMM, per un massimo di 10 giorni. Oltre il 95% delle cellule erano positive per CD14 come testato mediante citometria a flusso. CD14 è un recettore pattern recognition espressa principalmente dai macrofagi. Determinando la percentuale di cellule positive per questo recettore, è stata generata una coltura pura di BMMs aderenti.

Nota: preparare e coltivare le cellule di conseguenza se si utilizzano altri tipi di cellule.

2. Rivestimento di Microbeads come fagocitaria Cargo

  1. Per la preparazione di 1 ml di sospensione tallone, utilizzare 400 ml di 2,5% 3 micron microparticelle di polistirene carbossilati, o microparticelle alternativi.
  2. Trasferire la sospensione di sferette in una provetta da 1,5 ml, lavare 3x con PBS e aggiungere 100 ml di 500 mM 2 - (N-morpholino) etanisale sodico ulfonic, tampone MES a pH 6,7 al pellet tallone.
  3. Sciogliere 50 mg IgG di topo (anticorpo policlonale IgG) in 50 microlitri sterile DDH 2 O e aggiungere alla sospensione di sferette.
  4. Riempire la sospensione fino a 1 ml di DDH 2 O sterile (450 ml).
  5. Incubare la soluzione per 15 min su una ruota girevole a RT.
  6. Preparare EDAC cross-linker, N-(3-dimetilamminopropil) cloridrato-N'-etilcarbodiimmide in una concentrazione di 10 mg / ml e aggiungere 14 microlitri di sferette.
    Nota: EDAC legami incrociati ammino gruppi della IgG con i gruppi carbossilici sulla superficie delle perle e facilita l'immobilizzazione della IgG sulla superficie delle sfere. Questo è fondamentale per tallone assorbimento e quindi la soluzione deve essere preparata al momento.
  7. Incubare la sospensione su una ruota girevole per 1 ora a RT.
  8. Aggiungere 14 ml di EDAC cross-linker e incubare la sospensione su una ruota girevole per 1 ora a RT.
  9. Centrifugare la sospensione a 10.000 xg per 2 minuti in una microcentrifuga.
  10. Lavare le perline 3x in tampone di arresto (1% Triton X-100 in Tris 10 mM, pH 9,4) per fermare la reazione di reticolazione, per risospendere il pellet in tampone di arresto e la filatura della soluzione a 10,000 xg per 2 min.
  11. Lavare perle 3x in PBS e risospendere il pellet in 1 ml di PBS.
    Optional: Preparare aliquote di lavoro di 30-50 ml.
  12. Conservare la sospensione di sferette IgG-rivestito a 4 ° C per non più di 4 settimane e non lasciare la sospensione da congelare.

Nota: Un conservante quale azide di sodio ad una concentrazione finale di 0,02% (w / v) possono essere aggiunti alla sospensione per prevenire la crescita batterica e la contaminazione. In questo caso il lavaggio delle microsfere prima del suo utilizzo deve essere eseguito per evitare effetti citotossici del conservante. Centrifugare un'aliquota della sospensione a 10.000 xg per 2 minuti e lavare i beads di resospende il pellet in PBS. Ripetere il lavaggio 3x.

3. Preparazione del Dextran sonda Stock Solution

  1. Sciogliere il Texas Red 70.000 kilodalton Dextran (Dex70kD) in PBS a 20 mg / ml e conservare a -20 ° C, secondo le istruzioni del produttore.
    Nota: Conservare le scorte a -20 ° C fino a diversi mesi, o a 4 ° C per alcune settimane, vedere la documentazione del produttore.
  2. Preparare la soluzione di destrano per l'esperimento dallo stock diluendolo in mezzo completo di coltura cellulare DMEM (DMEM, 10% FCS, 2 mM L-glutammina) a circa 1 mg / ml (molteplice soluzione concentrata che verrà diluito alla concentrazione finale di lavoro di 20 mcg / ml prima dell'aggiunta alle cellule).
  3. Utilizzare una ecografia bagnomaria per sonicare parte aliquota destrano per 5 minuti per omogeneizzare la soluzione e sciogliere aggregati che potrebbero poi portare alla generazione di artefatti durante l'imaging.
  4. Centrifugare a massimo gper 5 min in una microcentrifuga per rimuovere eventuali grumi non disciolti o contaminanti dalla soluzione.
  5. Spostare con cautela il surnatante in una nuova provetta evitando il pellet sul fondo della provetta e diluire la soluzione alla concentrazione di lavoro finale di 20 pg / ml in mezzo completo di coltura cellulare DMEM.
  6. Filtro sterile la soluzione con un filtro montato 0,2 micron siringa.

4. Dextran precaricamento

  1. Cellule seme in un imaging cellulare piatto fondo di vetro dal vivo e incubare per almeno 12 ore (a 37 ° C in 5% di CO 2 nell'atmosfera) al fine di garantire l'attaccamento e acclimatazione.
    Nota: Ci sono piatti fondo di vetro segmentato disponibili che consentono di eseguire più esperimenti (fino a quattro compartimenti) per ogni piatto.
  2. Preparare la destrano in soluzione DMEM come descritto nel protocollo 3. Riscaldare il destrano preparato in soluzione DMEM, utilizzando un bagno di acqua a 37 ° C.
  3. Aspirare il terreno di unnd aggiungere la soluzione di destrano alle cellule attentamente e incubare a 37 ° C in 5% CO 2 ambiente per 2-8 ore per l'assorbimento.
    Nota: Piano e ottimizzare il protocollo basato sul tipo di sonda e cella che viene utilizzato e rigorosamente rispettare tale durata quando ripetendo esperimenti. Ciò è essenziale per il profilo di accumulo destrano nella via endocitosi e quindi riproducibilità degli esperimenti.
  4. Lavare le cellule 3x con preriscaldata mezzo completo DMEM, medie aspirare e lavare le cellule accuratamente con terreno fresco.
  5. Incubare le cellule con mezzo DMEM completo per 4-12 ore a 37 ° C in 5% CO 2 nell'atmosfera.
  6. Lavare le cellule una volta con mezzo completo DMEM privo di rosso fenolo filtrato preriscaldata.
  7. Per ottenere risultati ottimali di imaging, modifica preriscaldata completa fenolo filtrata DMEM senza rosso medium almeno 30 min prima dell'inizio della rappresentazione. Rosso fenolo può causare spegnimento dei segnali fluorescenti, aumentando il rumore di fondo equindi ridurre il contrasto e la nitidezza delle immagini.

Nota: Impostare il microscopio e le impostazioni di imaging di anticipo, secondo il protocollo preplanned e ottimizzata in base al tipo di sonda e le cellule che vengono utilizzati.

5. Aggiunta Beads IgG rivestite

  1. Equilibrare una aliquota di preprepared 1% sospensione di sferette di RT e sonicare in un bagno d'acqua ad ultrasuoni per 2-3 min.
  2. Aggiungere 1-6 ml di sferette 1% per il terreno completo filtrata fenolo-rosso DMEM privo sotto un armadio biosicurezza classe II per minimizzare il rischio di contaminazione (una buona concentrazione iniziale è di 1 ml / 2 cm 2 di superficie piatto).
    Nota: Qui BMMs sono state seminate in 25.000 cellule / pozzetto e un 6 ml di 1% di sospensione di magazzino tallone è stato aggiunto al mezzo nel piatto. Ciò equivale a circa un rapporto perla / cella 15:01. Il rapporto deve essere adattata al tipo di cellule che viene utilizzato e al materiale tallone; i.e. perle di lattice hanno una bassa densità e non si depositano sul fondo rapidamente, mentre perle di polistirene affondano e vengono a contatto con le cellule aderenti molto più veloce e quindi in numero maggiore.
    Nota: A seconda dell'esperimento, può essere vantaggioso per selezionare la regione che verrà osservato in anticipo. Sospensione tallone può essere aggiunto solo a quella regione specifica del piatto fondo di vetro, aumentando quindi la probabilità di osservare eventi assorbimento favorevoli.
  3. La nube densa di perline può essere diffuso pipettando delicatamente la sospensione nel piatto fondo di vetro.
  4. Attendere fino perline depositano sul fondo del piatto fondo di vetro e sono approssimativamente nello stesso piano con i fagociti aderenti.
  5. Focus sulla regione di interesse (ROI) e avviare il time-lapse imaging.

Nota: Può essere necessario ottimizzare la messa a fuoco delle immagini è in corso, a seconda del sistema di imaging che viene utilizzato, la sua stazionebilità e la mobilità delle cellule osservate. Si noti tuttavia che ciò può rendere impossibile, la corretta analisi dei fagosomi che si discostano fortemente dal piano di messa a fuoco come risultato di rifocalizzazione.

6. Imaging

Seguire le istruzioni riportate di seguito per una qualità ottimale delle immagini;

  1. Utilizzare un sistema di imaging confocale come un sistema laser-scansione o rotazione del disco.
    Nota: Una Leica TCS SP5 AOBS Laser microscopio confocale a scansione controllata dal software Leica LAS AF e dotato di una camera di controllo ambientale è stato utilizzato qui per immagini video time-lapse.
  2. Ottimizzare le impostazioni di imaging come la velocità di scansione, ingrandimento, risoluzione, ecc. in modo da consentire una velocità di un frame in ogni 7-20 secondi, a seconda del sistema utilizzato.
    Nota: Qui, una velocità di scansione di 200 Hz, con zoom 2x scanner e una media di linea 2-3x con una risoluzione di 512 x 512 pixel resulted in un tempo di registrazione tra 3-5 sec / rame. Una frequenza di un telaio in ogni 10 sec è stato usato per registrare i filmati time-lapse con una durata di almeno 120 min.
  3. Utilizzare appropriate impostazioni di eccitazione / emissione basati sul sistema utilizzato per immagini e sonda (s).
    1. Ottimizzare le impostazioni per evitare un eccessivo fotometabolismo.
      Nota: Qui, il Texas Red Dextran 70kD era eccitato utilizzando un DPSS (561 nm) del laser e l'emissione di luce è stato rilevato da un rilevatore ibrido Leica (HYD) a 600-650 nm con il picco di emissione a 610 nm. Intensità del laser deve essere adattato per l'intensità del segnale e mantenuto il più basso possibile per minimizzare fotometabolismo del fluoroforo (s) e foto effetto tossicità della luce laser sulle cellule. In generale, è importante bilanciare la velocità di scansione, linea media, risoluzione di scansione, intervallo fotogrammi e la durata della rappresentazione avere adeguata e stabile l'intensità del segnale e catturare tutta la durata del branello assorbimento e phagosome maturazione process.
  4. Includere un campo chiaro (BF) canale di osservazione dei branelli se non sono coniugati con un fluorocromo.
    Nota: Accanto canale Rosso Texas, canale BF è stato usato per la visualizzazione delle sfere, lo stesso laser DPSS è stato utilizzato come sorgente di luce e il segnale è stato rilevato con un fotomoltiplicatore (PMT) rivelatore.
    Nota: Assicurarsi di applicare le impostazioni di registrazione identici quando l'acquisizione di dati che devono essere raccolti. Parametri più importanti sono: intensità del laser di eccitazione, l'impostazione del rivelatore, le impostazioni di acquisizione, l'ingrandimento e gli intervalli di frame. Non usando intervalli di frame identici richiederà una fase di curva-media, come i punti di dati di osservazione non si sovrappongono (ad esempio per raccogliere una osservazione con fotogrammi acquisiti ad ogni 7 secondi con un altro set con cornici ad ogni 12 sec). Ciò aumenterebbe i passi necessari per la valutazione dei dati e richiedono software aggiuntivo con funzione di curva-media, come OriginLab 's Origin software statistiche Pro ( http://www.originlab.com/ ).
  5. Preferibilmente, salvare il time-lapse video in file formato nativo del sistema di imaging utilizzata e di evitare l'esportazione in formati compressi.

Nota: Qui, filmati time-lapse sono stati salvati nel formato Leica LAS AF nativo i file, che sono stati poi importati direttamente da aprire in Fiji (LIF.). Fiji è in grado di leggere i formati di file nativi dalla maggior parte dei produttori microscopio utilizzando la dotazione Bio formati importatore plug-in. Esportare il file del filmato time-lapse in una serie di immagini con JPG o TIFF o come file video in un formato contenitore AVI non è necessario o consigliato. Oltre a preservare la migliore qualità possibile dell'immagine dall'osservazione originale evitando algoritmi di compressione lossy (ad esempio JPEG), utilizzando il formato di file nativo microscopio assicura che i meta-dati del file (timestamp, ingrandimento, laser e acquisizione intensità, Impostazioni del rivelatore, ecc) vengono conservati e disponibili a Fiji. Tuttavia, se per qualsiasi motivo, i file video time-lapse devono essere esportati in un formato diverso per l'analisi, assicurarsi di utilizzare formati di file compressi come la serie di immagini TIFF e colore RGB separati (rosso, verde, blu) i canali già in questa step, come Fiji spesso non possono separare con successo il canale BF da altri canali di colore nei file esportati. Inoltre, assicurarsi di conservare i file originali microscopio come riferimento.

7. L'analisi dei filmati time-lapse

  1. Utilizzare ImageJ, Fiji o qualsiasi altro software che fornisce una capacità di analisi di associazione segnale analoghi.
    Nota: Qui, Fiji è stato utilizzato per l'analisi di filmati time-lapse. Fiji è una distribuzione ImageJ contenente un pacchetto di elaborazione delle immagini con i menu degli strumenti riorganizzati e plug-in nativi, disponibile per il download gratuito a http://fiji.sc . Il processo descritto in questa settaione è illustrato nella Figura 2.
  2. Aprire il file in Fiji facendo clic su "File", "Apri" e scegliendo il file, o trascinando il file Fiji.
  3. Scegliere le seguenti opzioni;
    1. Stack di visualizzazione: Visualizza pila con HyperStack,
    2. Opzioni di colore: Modo colore colorato,
    3. Canali suddivisi in finestre separate: canali Split (per ogni colore RGB-channel che è stata registrata saranno aperte una finestra separata).
  4. Nel caso in cui una serie di immagini deve essere usato, caricare la serie di Fiji andando su "File", "Importa", "Sequenza d'immagini" e scegliere un file immagine nella cartella che contiene la serie immagine di destinazione.
    1. Impostare i filtri e le condizioni per il caricamento immagini selezionate nella serie, ad esempio;
      1. Numero di immagini: quanti fotogrammi devono essere caricati.
      2. Partendo immagine: quale immagine è il fotogramma iniziale della serie.
      3. Incrementa: l'incremento trafotogrammi da caricare (ogni fotogramma, ogni secondo fotogramma, ecc.).
      4. Il nome del file contiene: filtraggio per il canale specifico utilizzando il nome del file (ad esempio impostando "c001", che è come normalmente le immagini da "Channel 1" sono etichettati dopo il colore separazione di un video time-lapse multicanale).
  5. Rimuovere scala andando su "Analizza", "Imposta scala ...", selezionando la casella "Global" e cliccando su "Clicca per rimuovere incrostazioni".
    Nota: Questo passo permette l'analisi basata sui pixel delle immagini in caso di ingrandimenti diversi sono stati utilizzati per i vari set sperimentali che devono essere valutati. Se le impostazioni di ingrandimento sono stati sempre mantenuto costante e il file microscopio nativo è stato direttamente importato in Fiji, questo passaggio può essere saltato, come Fiji in grado di comprendere e utilizzare i dati di ingrandimento e di scala di metadati del file microscopio.
  6. Impostare parametro di misuras andando su "Analizza", "Set Misure" e selezionando le seguenti caselle: "Area", "deviazione standard", "densità Integrata", "label Visualizzazione" e "Mean valore di grigio".
  7. Reindirizzare al canale colori che contiene il segnale dalla sonda che deve essere misurato e confermare con "OK".
  8. Va al frame in cui le misure sono da avviare e selezionare la finestra canale BF cliccando sul bordo superiore della finestra.
  9. Utilizzare lo "strumento di selezione ovale" per selezionare la regione di interesse (ROI), cioè un ROI circolare sul tallone interiorizzato. Assicurarsi che la selezione è montato saldamente al bordo esterno del tallone come visibile nel canale BF.
    Nota: Quando si utilizza un PC, tenere premuto il tasto Shift mentre si utilizza lo strumento di selezione per garantire un ROI circolare.
  10. Avviare la misura ottimale di alcuni fotogrammi prima della piena fagocitazione del cordone viene completata e notare lacornice in cui si forma una nascente branello-phagosome completamente formato e la coppa fagocitica è chiusa. Questo dovrebbe essere relativamente chiaramente distinguibile nel canale BF.
  11. Vai su "Analizza" e cliccare su "Misura" per eseguire la misura, il risultato verrà visualizzato in una finestra separata dal titolo "Risultati".
  12. Va al frame successivo, regolare la posizione della ROI nel caso che il tallone è mosso, e ripetere la misurazione. Il risultato verrà aggiunto alla lista nella finestra dei risultati; ogni fotogramma analizzato può essere identificato in base al valore nella colonna "Label".
    Nota: Utilizzo dei tasti di scelta rapida (ad esempio, "M" per la misura) può significativamente accelerare il processo di valutazione; vedere l'elenco di scorciatoie e assegnare quelli costume sotto il menu "Plugins".
  13. Dopo aver completato la misurazione di tutti i fotogrammi rilevanti, i risultati possono essere copiati su un foglio di calcolo come MS Excel. La colonna "IntDen" raffigura la intensities della regione selezionata nel canale che la misurazione è stata reindirizzato.

8. Correzione Sbiancamento

A seconda della sonda utilizzata e impostazioni di imaging, può verificarsi fotometabolismo. A seconda della sua portata, questo potrebbe influenzare fortemente il risultato della valutazione. Tuttavia, questo effetto può essere parzialmente corretto applicando un tasso uguale ma opposta di modifica dei valori misurati. Se presente, il coefficiente fotometabolismo può essere calcolato misurando la diminuzione dipendente dal tempo dell'intensità di segnale in tutto il telaio, o area specificamente ritagliata del telaio, durante il lasso di tempo rilevante per l'analisi di ogni phagosome. Questo processo è illustrato nelle figure 3 e 4.

  1. Sotto il menu "Plugins" di Fiji, utilizzare la funzione "Time Series Analyzer" plug-in per determinare il calo generale in tutto il fotogramma, o ROI specifica intensità di segnale della sonda nel tempo (Figura 3).
    Nota: Time Series Analyzer plug-in è disponibile per il download all'indirizzo http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.html , nel caso non sia già presente nel menu Plugins.
  2. Tracciare la misura contro il tempo (in secondi) in MS Excel, solo per i frame che corrispondono ai fotogrammi di un phagosome analizzato.
  3. Applicare una linea di tendenza lineare (Figura 4A) del terreno; una pendenza negativa per il segnale discendente indica la presenza di effetto fotoindotto.
  4. Applicare la pendenza invertita di valori da una phagosome analizzati (figure 4B e 4C): intensità del segnale rettificato (SI) = raw SI + (tempo in secondi * retromarcia pendenza)

Nota: ogni singolo phagosome analizzato avrà un determinato lasso di tempo (a partire da cornice assorbimento completo) durante un filmato time-lapse registrato, la foto-bleacHing deve essere ricalcolato per quel lasso specifico e sarà valida solo per correggere i valori misurati da quella specifica phagosome.

9. Valutazione dei dati

  1. Collazionare i dati e calcolare l'errore medio e statistica dei valori sbiancanti corretta nel software appropriato.
  2. Tracciare i dati valutati in forma adeguata.

Nota: Qui, le statistiche scientifiche e tramando software GraphPad Prism ( http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ ) è stato utilizzato. Software Prism è in grado di generare e tracciare una curva media con gli indicatori di errore corrispondenti finché tutti i dati hanno la stessa frequenza di quadro (cioè tutti sono stati acquisiti con agli stessi intervalli, come un frame ogni 10 sec).

Nota: Ampie variazioni dei valori assoluti SI all'interno ripetizioni della stessa sperimset ent introdurrà molto grande errore statistico e rendere i dati inutilizzabili. Questo può essere il caso se il protocollo, ad esempio le impostazioni di imaging, non sono tenuti rigorosamente identici tra le diverse ripetizioni degli esperimenti che devono essere raccolti.

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Risultati

La corretta preparazione delle cellule e le perline per l'imaging è critica. Figura 1 mostra il profilo della semina, sonda-loading e gradini di imaging iniziale, in questo metodo, basato sulla nostra protocollo ottimizzato per BMMs. È pertanto indispensabile che i parametri di protocollo testati e ottimizzati a seconda del tipo di cellule e sonde che devono essere utilizzati.

Dopo l'aggiunta delle perline rivestite con IgG verso le cellule precaricati, è importante ...

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Discussione

Nella sezione seguente si discuterà fasi critiche del metodo presentato e le sue limitazioni. Inoltre, ci si collegherà alcuni dei problemi comuni con le loro soluzioni, introdurre eventuali modifiche e valutare i vantaggi del nostro metodo così come i metodi complementari adatti per questo approccio.

La preparazione delle perline, compreso l'accoppiamento di IgG di superficie delle sfere, è cruciale e l'uso di preparati unfresh dovrebbe essere evitata. In aggiunta a ciò, è anche fon...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo i membri del Laboratorio di Biologia phagosome per la lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è supportato da una sovvenzione Helmholtz Young Investigator (Iniziativa e Networking fondi dell'Associazione Helmholtz) e un programma di priorità SPP1580 Concessione del Consiglio per la ricerca tedesca (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Dulbecco's Modified Eagles Medium (D-MEM)PAA, AustriaE15-009
Dulbecco's Modified Eagles Medium senza rosso fenolo (D-MEM)PAA, AustriaE15-047
Fetale Siero Bovino (FBS)PAA, AustriaA15-151
L-GlutamminaPAA, AustriaM11-004
PBSPAA, AustriaH15-002
Penicillina/StreptomicinaPAA, AustriaP11-010
WillCo-dish® Piatto con fondo in vetro (35 mm &vuoto;, #1.5)WillCo Wells, Paesi BassiGWSt-3522
CELLviewTM piatto con fondo in vetro, 35 mmGreiner Bio one, Germania627871Alternativa: Disponibile come
microsfere di lattice carbossilatoPolysciences, USA#09850Disponibile in diversi diametri, abbiamo usato 3 μ m
Microparticelle di polistireneKisker Biotech, GermaniaPPs-3.0COOH
Triton-X 100ROTH, Germania305.1.3
topo intero IgGRockland, USA010-0102
EDAC reticolanteSigma-Aldrich, USAE6383-1g
10 mM TrisSigma-Aldrich, USAT1503
siringa da 1 ml Omnifix -FB.Braun, Germania9161406V
26  Ago G (0,45 * 25 mm)B.Baun, Germania4657683
RPMI 1640PAA, AustriaE15-039
Siero di cavalloGibco, USA16050-122
MES idratareSigma-Aldrich, USAM2933
0,2 μ Filtro montato su siringa MSartorius, Germania83.1826.001
segmentato

Riferimenti

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