Studier av Phagolysosome Biogenesis i Levende Macrophages
Abstract
Fagocytiske celler spiller en viktig rolle i det medfødte immunsystemet ved å fjerne og eliminere invaderende mikroorganismer i sine phagosomes. Phagosome modning er komplekse og tett regulert prosess der en gryende phagosome gjennomgår drastisk forvandling gjennom godt orkestrert interaksjoner med ulike cellulære organeller og oppbevaringsrom i cytoplasma. Denne prosessen, som er avgjørende for den fysiologiske funksjon av fagocytiske celler ved endowing phagosomes med sine lytiske og bakteriedrepende egenskaper, kulminerer i fusjon av phagosomes med lysosomer og biogenesis av phagolysosomes som anses å være den siste og avgjørende fasen av modning for phagosomes. I denne rapporten beskriver vi en levende celle bildebehandling basert metode for kvalitativ og kvantitativ analyse av dynamisk prosess med lysosome å phagosome innhold levering, noe som er et kjennetegn på phagolysosome biogenesis. Denne fremgangsmåten anvender IgG-belagte mikroperler som en modell for phagocyTosis og fluoroforen-konjugert dekstran-molekyler som luminal lysosomal last probe, for å kunne følge den dynamiske levering av lysosmal innholdet til de phagosomes i sanntid i levende makrofager ved hjelp av time-lapse avbildning og konfokal laser-skanning mikroskopi. Her beskriver vi i detalj bakgrunnen, forberedelsestrinnene og trinn-for-trinn eksperimentelt oppsett som gir enkel og presis distribusjon av denne metoden i andre laboratorier. Vår beskrevet metoden er enkel, robust, og viktigst, kan enkelt tilpasses for å studere phagosomal interaksjoner og modning i ulike systemer og under ulike eksperimentelle innstillinger som bruk av ulike fagocytiske celler typer, tap-av-funksjon eksperimenter, ulike prober, og fagocyttiske partikler.
Introduction
Profesjonelle fagocytter, inkludert makrofager, spille en avgjørende i immunsystemet. I tillegg til å være den første linjen i forsvaret i det medfødte immunsystem, de spiller også en avgjørende rolle i aktivering av adaptiv immunitet gjennom deres signalering og antigenpresenterende rolle 1-3. Mens funksjon av profesjonelle fagocytter er mangefasettert, er phagosome modning den kritiske ryggraden i bakteriedrepende og antigen prosessering funksjon av de profesjonelle fagocytter 4,5. Ved å reseptor mediert engulfment og opptak av en fagocytisk mål, slik som bakterier, går den begynnende phagosome gjennom en kompleks og velorganisert sekvens av interaksjon og utvekslingen med avdelinger av endocytic nettverk og flere andre cellulære organeller 6. Naturen av forbindelsene utvekslet med disse cellulære enheter samt regulering og timingen av fusjonshendelser bestemmer luminal phagosomal miljøet og de phagosomal membran sammensetning og dermed 7, skjebnen til modning phagosome åtte.
Den fysiologiske betydningen av phagosome modning er eksemplifisert ved de ulike strategier ansatt av ulike intracellulære patogener å flykte fra, arrestere eller grave phagosome modning ni. De fleste av disse strategiene er direkte eller indirekte hindre at den siste og avgjørende trinn i phagosome modningsprosess: fusjon av phagosome med sen endosomal / lysosomale rom, hvilket endows dem med hoveddelen av hydrolytiske enzymer og anti-bakterielle faktorer for et modent phagosome 7 , 8,10. Analyse av denne endelige og avgjørende skritt kan derfor gi oss sterke indikatorer om tilstanden i modningen av phagosomes og hvis den naturlige fysiologiske tilstand er å være positivt eller negativt påvirket under spesielle eksperimentelle innstillinger som blir utnyttet.
Den avdøde endosomal / lysosomal rommets er generelt ansett for å være de terminal avdelinger av endocytoseveien, definert og aner fra tidlig endocytiske avdelinger ved tilstedeværelse av ulike, scene spesifikke, markør molekyler. For eksempel hydrolytic enzymer eller membrankomponenter som Lysosomal assosiert membran proteiner (lamper) blant andre 11. Terminalen endocytic avdelinger-heretter bare kalt lysosomer-også tjene som den viktigste plasseringen for sluttfasen av fordøyelsen ved utgangen av fagocyttisk / endocytoseveien 12. På denne måte kan ikke-fordøyelige prober bli lastet via endocytose og macropinocytosis fra det ekstracellulære miljø og transportert gjennom endocytoseveien til lysosomene hvor det akkumuleres 13,14 etter å ha fulgt en definert syklus av opptak og jakten. Fluoroforpar-konjugert prober for fluoriserende mikroskopi som den organiske fordøyelige polymer dekstran blir ofte brukt som endocyticprobes 15-17.
<p class = "jove_content"> I denne metoden, beskriver vi bruken av IgG-belagte mikroperler som fagocytisk lasten for å undersøke phagosome modning ved å analysere levering av lysosomal luminale innhold til phagosomes. Ved å bruke en fluoroforen-konjugert dekstran sonde som et lett påviselig markør Lysosomers i levende benmarg avledet makrofager (BMM) og time-lapse video bildebehandling med en confocal laser-scanning mikroskop, følger vi den dynamiske prosessen med last levering i phagosomes med høy tidsmessig oppløsning. Vi beskriver deretter hvordan de innsamlede time-lapse imaging data kan evalueres ved hjelp av åpen kildekode og fritt tilgjengelig programvare for bildeanalyse, Fiji (eller ImageJ), analysert statistisk ved hjelp av Microsoft Excel og presentert ved hjelp av GraphPad Prism programvare 14,18.Etter beskrivelsen av foreliggende fremgangsmåte kan analoge eksperimenter være utformet ved bruk av modifiserte innstillinger og forhold for å undersøke deres innflytelse på phagosome modning, praktisk talt en hvilken som helst othennes type heft primære eller celle linjer fagocytiske celler, genetisk tap av funksjons eksperimenter inkludert genet knock-out og knock-down, mutanter eller uttrykk for fusjonsproteiner, fagocyttiske-mål, microbead belegg forbindelser, endosomal / lysosomale prober og faktorer som en cytokiner, kjemiske hemmere, eller siRNA blant andre er alle variabler som kan brukes til grunnleggende tilnærming av denne metoden.
Vi definerer mål og de grunnleggende kravene i denne metoden som følger:
- Målet med metoden: å muliggjøre direkte, kvantitativ og kvalitativ observasjon og analyse av phagosome modning med høy tidsoppløsning i levende fagocytiske celler.
- Phagocytic last: En riktig belagt mikropartikkel eller biologiske mål. Her bruker vi IgG-belagt tre mikrometer sfæriske polystyren mikropartikler som er lett internalisert via Fc-γ reseptor mediert fagocytose. Alternativt, noen mikroorganisme eller belagt microparticle hvor en fagocytisk reseptoren er tilstede i cellene kan anvendes.
- Fagocytiske celler: Adhererende fagocytiske celler som uttrykker de riktige fagocyttiske reseptorer. Her bruker vi muse primære BMMs som klinkende uttrykker Fc-γ reseptorer. Alternativt kan dendrittiske celler (DC), monocytter eller fagocyttiske epitelceller eller deres genetiske mutanter eller knock-out-varianter benyttes.
- Lysosomal last: En fluorescensmerkede lysosomal probe. Her er Texas Red-konjugert 70000 kiloDaltons dekstran (Dex70kD) brukes som luminal last av lysosomene. Alternativt kan en hvilken som helst fluorescerende detekterbare markør for cellerommet eller organeller, eller en egnet probe for phagosomal egenskaper slik som syre-eller nedbrytende kapasitet, kunne brukes for å studere utviklingen av phagosome modning.
- Påvirkende faktorer: For eksempel signalmolekyler, kjemiske forbindelser, genet knock-down, eller forbigående uttrykk av muterte proteiner kunne. Her har vi Forgen bruk av en slik faktor for enkelhets skyld, men for et nylig eksempel med mutant protein uttrykk og knock-down påvirkende faktorer kan se Kasmapour et al. 18 Enhver faktor som kan påvirke fagocytose eller omstendighetene og mobilitet av phagosomes og / eller de avdelinger som samhandler med modning phagosomes kan potensielt brukes.
Protocol
Representative Results
Discussion
I neste avsnitt vil vi diskutere kritiske trinn av det presenterte metoden og dens begrensninger. Videre vil vi koble noen av de vanligste problemene med sine løsninger, introdusere mulige modifikasjoner og vurdere fordelene med vår metode samt egnede komplementære metoder for denne tilnærmingen.
Fremstillingen av kulene, blant annet koblingen av IgG til perleoverflaten, er avgjørende, og bruken av unfresh preparater bør unngås. I tillegg til det, er det også avgjørende at dekstran …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker medlemmene av phagosome Biology Laboratory for kritisk lesing av manuskriptet. Dette arbeidet støttes av en Helmholtz Young Investigator Grant (Initiative og Nettverk midler av Helmholtz Association) og en Priority Program SPP1580 Grant av den tyske Research Council (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagles Medium (D-MEM) | PAA, Austria | E15-009 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium without phenol red (D-MEM) | PAA, Austria | E15-047 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA, Austria | A15-151 | |
| L-Glutamine | PAA, Austria | M11-004 | |
| PBS | PAA, Austria | H15-002 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA, Austria | P11-010 | |
| WillCo-dish® Glass bottom dish (35 mm ∅, #1.5) | WillCo Wells, Netherlands | GWSt-3522 | |
| CELLviewTM glass bottom dish, 35 mm | Greiner Bio one, Germany | 627871 | Alternative: Available as segmented |
| Carboxylated latex microspheres | Polysciences, USA | #09850 | Available in different diameters, we used 3 μm |
| Polystyrene microparticles | Kisker Biotech, Germany | PPs-3.0COOH | |
| Triton-X 100 | ROTH, Germany | 305.1.3 | |
| mouse whole IgG | Rockland, USA | 010-0102 | |
| EDAC crosslinker | Sigma-Aldrich, USA | E6383-1g | |
| 10 mM Tris | Sigma-Aldrich,USA | T1503 | |
| 1-ml syringe Omnifix -F | B.Braun, Germany | 9161406V | |
| 26 G needle (0.45*25 mm) | B.Baun, Germany | 4657683 | |
| RPMI 1640 | PAA, Austria | E15-039 | |
| Horse Serum | Gibco, USA | 16050-122 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich, USA | M2933 | |
| 0.2 μM syringe mounted filter | Sartorius, Germany | 83.1826.001 |
Riferimenti
- Greenberg, S., Grinstein, S. Phagocytosis and innate immunity. Curr. Opin. Immunol. 14, 136-145 (2002).
- Jutras, I., Desjardins, M. Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 511-527 (2005).
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science. 327, 291-295 (2010).
- Stuart, L., Ezekowitz, R. Phagocytosis: elegant complexity. Immunity. 22, 539-550 (2005).
- Blander, J. M., Medzhitov, R. On regulation of phagosome maturation and antigen presentation. Nat. Immunol. 7, 1029-1035 (2006).
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu. Rev. Pathol. 7, 61-98 (2012).
- Vieira, O. V., Botelho, R. J., Grinstein, S. Phagosome maturation: aging gracefully. Biochem. J. 366, 689-704 (2002).
- Haas, A. The phagosome: compartment with a license to kill. Traffic. 8, 311-330 (2007).
- Flannagan, R. S., Cosio, G., Grinstein, S. Antimicrobial mechanisms of phagocytes and bacterial evasion strategies. Nat Rev Microbiol. 7, 355-366 (2009).
- Luzio, J., Pryor, P., Bright, N. Lysosomes: fusion and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 622-632 (2007).
- Huotari, J., Helenius, A. Endosome maturation. EMBO J. 30, 3481-3500 (2011).
- Luzio, J. P., et al. Lysosome-endosome fusion and lysosome biogenesis. J. Cell. Sci. 113 (pt 9), 1515-1524 (2000).
- Eissenberg, L., Goldman, W. Fusion of lysosomes with phagosomes containing Histoplasma capsulatum: use of fluoresceinated dextran). Adv. Exp. Med. Biol. 239, 53-61 (1988).
- de Souza Carvalho, C., et al. Internalization, phagolysosomal biogenesis and killing of mycobacteria in enucleated epithelial cells. Cell. Microbiol. 13, 1234-1249 (2011).
- Wang, Y. L. Differential and sequential delivery of fluorescent lysosomal probes into phagosomes in mouse peritoneal macrophages. J. Cell Biol. 104, 1749-1754 (1987).
- Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. Phagosomes Fuse with Late Endosomes and/or Lysosomes by Extension of Membrane Protrusions along Microtubules: Role of Rab7 and RILP. Mol. Cell. Biol. 23, 6494-6506 (2003).
- Huynh, K. K., et al. LAMP proteins are required for fusion of lysosomes with phagosomes. EMBO J. 26, 313-324 (2007).
- Kasmapour, B., Gronow, A., Bleck, C., Hong, W., Gutierrez, M. Size-dependent mechanism of cargo sorting during lysosome-phagosome fusion is controlled by Rab34. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 20485-20490 (2012).
- Snijder, B., et al. Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection. Nature. 461, 520-523 (2009).
- Knight, M., Roberts, S., Lee, D., Bader, D. Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284, 9 (2003).
- Hemmi, H., et al. A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA. Nature. 408, 740-745 (2000).
- Underhill, D., Ozinsky, A. Toll-like receptors: key mediators of microbe detection. Curr. Opin. Immunol. 14, 103-110 (2002).
- Bohdanowicz, M., Cosío, G., Backer, J., Grinstein, S. Class I and class III phosphoinositide 3-kinases are required for actin polymerization that propels phagosomes. J. Cell Biol. 191, 999-1012 (2010).
- Hoffmann, E., et al. Initial receptor-ligand interactions modulate gene expression and phagosomal properties during both early and late stages of phagocytosis. Eur. J. Cell Biol. 89, 693-704 (2010).
- Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. The kinetics of phagosome maturation as a function of phagosome/lysosome fusion and acquisition of hydrolytic activity. Traffic. 6, 413-420 (2005).
- Savina, A., et al. NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells. Cell. 126, 205-218 (2006).
- Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. Recording phagosome maturation through the real-time, spectrofluorometric measurement of hydrolytic activities. Methods Mol. Biol. 531, 157-171 (2009).
- Russell, D., Vanderven, B., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function. Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).
- Hoffmann, E., et al. Autonomous phagosomal degradation and antigen presentation in dendritic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14556-14561 (2012).
- Tan, S., Sukumar, N., Abramovitch, R., Parish, T., Russell, D. Mycobacterium tuberculosis Responds to Chloride and pH as Synergistic Cues to the Immune Status of its Host Cell. PLoS Pathog. 9, (2013).
- Aziz, M., Yang, W. -. L., Wang, P., Coliganet, J. E. Measurement of phagocytic engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Current protocols in immunology. 14, (2013).
- Rogers, L., Foster, L. The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 18520-18525 (2007).
- Russell, D. G., Vanderven, B. C., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. S. The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function. Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).
- Savina, A., Vargas, P., Guermonprez, P., Lennon, A. -. M., Amigorena, S. Measuring pH, ROS production, maturation, and degradation in dendritic cell phagosomes using cytofluorometry-based assays. Methods. Mol. Biol. 595, 383-402 (2010).
