Studie av Phagolysosome biogenes i Live Makrofager
Abstract
Fagocytiska celler spelar en viktig roll i det medfödda immunförsvaret genom att ta bort och eliminera invaderande mikroorganismer i sina phagosomes. Phagosome mognad är den komplexa och hårt reglerad process under vilken en begynnande phagosome genomgår drastisk förvandling genom väl iscensatt interaktion med olika cellulära organeller och fack i cytoplasman. Denna process, som är avgörande för den fysiologiska funktionen av fagocyterande celler genom att förse phagosomes med deras lytiska och bakteriedödande egenskaper, kulminerar i fusion av phagosomes med lysosomer och biogenes av phagolysosomes som anses vara den sista och avgörande skede av mognad för phagosomes. I denna rapport beskriver vi en levande cell imaging baserad metod för kvalitativ och kvantitativ analys av den dynamiska processen för lysosom att phagosome innehållsleverans, vilket är ett kännetecken för phagolysosome biogenesis. Detta tillvägagångssätt använder IgG-belagda mikropärlor som en modell för phagocytosis och fluoroforen-konjugerade dextran molekyler som luminal lysosomala last sond, för att följa den dynamiska leverans av lysosmal innehåll till phagosomes i realtid i levande makrofager med hjälp av time-lapse avbildning och konfokal laserskanning mikroskopi. Här beskriver vi i detalj bakgrunden, de förberedande stegen och den steg-för-steg experimentuppställning för att möjliggöra enkel och exakt utplacering av denna metod i andra laboratorier. Vår beskrivna metoden är enkel, robust, och viktigast, kan lätt anpassas för att studera phagosomal interaktioner och mognad i olika system och under olika experimentella inställningar såsom användning av olika fagocytceller typer, förlust-av-funktion experiment, olika sonder, och fagocytiska partiklar.
Introduction
Professionella fagocyter, däribland makrofager, spelar en avgörande i immunsystemet. Förutom att vara den första försvarslinjen i det medfödda immunförsvaret, de också spela en avgörande roll i aktiveringen av den adaptiva immuniteten genom sin signalering och antigenpresenterande roll 1-3. Medan funktionen av professionella fagocyter är mångfacetterad, är phagosome mognad den kritiska ryggraden i bakteriedödande och antigenprocess funktion av professionella fagocyter 4,5. När receptorn medi omvälvning och upptag av en phagocytic mål, såsom bakterier, går den begynnande phagosome genom en komplex och väl iscensatt sekvens av interaktion och utbyten med fack i endocytic nätverket och flera andra cellulära organ 6. Den typ av föreningar som utbyts med dessa cellulära enheter samt reglering och tidpunkten för fusionshändelser bestämmer luminala phagosomal miljön och de phagosOMAL membranets sammansättning och därmed 7, öde mognande phagosome 8.
Den fysiologiska betydelsen av phagosome mognad exemplifieras av de olika strategier som används av olika intracellulära patogener att fly från, arrestera eller gräva phagosome mognad 9. De flesta av dessa strategier som direkt eller indirekt hindrar det sista och avgörande steget i phagosome mognadsprocess: fusion av phagosome med sena endosomala / lysosomala fack, som förser dem med den största delen av hydrolytiska enzymer och antibakteriella faktorer av mogen phagosome 7 , 8,10. Analys av det sista och avgörande steget kan därför ge oss starka indikatorer om tillståndet i mognaden av phagosomes och om det naturliga fysiologiska tillstånd är att vara positivt eller negativt under de särskilda experimentella inställningar som tas i anspråk.
Den sena endosomala / lysosomala facks är i allmänhet anses vara terminal fack i endocytiska vägen, definierade och framstående från början endocytic facken genom förekomsten av olika, Scen specifika, markörmolekyler. Exempelvis hydrolytiska enzymer eller membrankomponenter såsom Lysosomal associerade membranproteiner (lampor) bland andra 11. Terminalen endocytic fack-hädanefter bara kallad lysosomer-också fungera som den viktigaste platsen för slutskedet av rötning vid slutet av fagocytiska / endocytic väg 12. På detta sätt kan icke-smältbara prober lastas genom endocytos och macropinocytosis från den extracellulära miljön och som transporteras genom den endocytiska banan till lysosomer, där det ackumuleras 13,14 efter att ha följt en definierad cykel av upptag och chase. Fluorofor-konjugerade sönder för fluorescensmikroskopi såsom det organiska icke-smältbar polymer dextran används vanligen som endocyticprobes 15-17.
<p class = "jove_content"> I denna metod beskriver vi användningen av IgG-belagda mikropärlor som fagocytisk last att undersöka phagosome mognad genom analys av leverans av lysosomala luminala innehåll till fagosomer. Genom att använda en fluorofor-konjugerat dextran sond som en lätt detekterbar markör av lysosomer i levande benmärg härledda makrofager (BMM) och time-lapse video avbildning med en konfokala laserskanning mikroskop, vi följer den dynamiska processen av last leverans till phagosomes med hög temporal upplösning. Vi beskriver sedan hur de insamlade tidsförlopp bilddata kan utvärderas med hjälp av öppen källkod och fritt tillgänglig bildanalys programvara, Fiji (eller ImageJ), statistiskt analyseras med hjälp av Microsoft Excel och presenteras med hjälp av GraphPad Prism mjukvara 14,18.Efter beskrivning av vår metod, kan analoga experiment utformas med hjälp av modifierade inställningar och faktorer för att undersöka deras inverkan på phagosome mognad, praktiskt taget alla othennes typ av fastsittande primära eller cell-linjer fagocytiska celler, genetisk förlust av funktions experiment inklusive gen knock-out och knock-down, mutanter eller uttryck av fusionsproteiner, fagocytiska-mål, microbead beläggning föreningar, endosomala / lysosomala sonder och faktorer som en cytokiner, kemiska hämmare, eller siRNA bland andra är alla variabler som kan användas till grundidén i denna metod.
Vi definierar målet och de grundläggande kraven i denna metod på följande sätt:
- Mål av metoden: att möjliggöra direkt, kvantitativ och kvalitativ observation och analys av phagosome mognad med hög tidsupplösning i levande fagocytceller.
- Fagocytiska last: En lämpligt belagd mikropartikel eller biologiska mål. Här använder vi IgG-belagda 3 ìm sfäriska polystyren mikropartiklar som lätt intern via Fc-γ receptormedierad fagocytos. Alternativt någon mikroorganism eller bestruket microparticle för vilken en fagocytisk receptor är närvarande på celler kan användas.
- Fagocytceller: Adherenta fagocytiska celler som uttrycker lämpliga fagocytiska receptorer. Här använder vi mus primära BMMs som rikligt uttrycker Fc-γ receptorer. Alternativt kan dendritiska celler (DC), monocyter eller fagocytiska epitelceller eller deras genetiska mutanter eller knock-out-varianter användas.
- Lysosomala last: En fluorescerande lysosomala sond. Här är Texas Red-konjugerad 70.000 kilodalton dextran (Dex70kD) används som luminala last av lysosomer. Alternativt får alla fluorescerande detekterbar markör för ett cellulärt fack eller organell, eller en lämplig prob för phagosomal egenskaper såsom surhet eller nedbrytande kapaciteten, skulle kunna användas för att studera utvecklingen av phagosome mognad.
- Påverkande faktorer: till exempel signalmolekyler, kemiska föreningar, gen knock-down, eller övergående uttryck av muterade proteiner kunde. Här har vi FÖRGen användning av en sådan faktor för enkelhetens skull, men för ett aktuellt exempel med mutant proteinuttryck och knock-down påverkande faktorer vänligen se Kasmapour et al. 18 Varje faktor som kan påverka fagocytos eller omständigheterna och rörlighet phagosomes och / eller de utrymmen som interagerar med förfall phagosomes skulle kunna användas.
Protocol
Representative Results
Discussion
I följande avsnitt kommer vi att diskutera kritiska steg i den presenterade metoden och dess begränsningar. Vidare kommer vi att ansluta några av de vanligaste problemen med sina lösningar, införa eventuella ändringar och överväga fördelarna med vår metod samt lämpliga kompletterande metoder för detta synsätt.
Framställningen av pärlorna, inklusive koppling av IgG till pärlytan, är av avgörande betydelse och användning av unfresh beredningar bör undvikas. I tillägg till …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar medlemmar i phagosome BiologiLaboratoriumet för kritisk läsning av manuskriptet. Detta arbete stöds av en Helmholtz Young Investigator Grant (Initiativ och nätverk medel från Helmholtz Association) och en prioritet Program SPP1580 Grant av det tyska forskningsrådet (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagles Medium (D-MEM) | PAA, Austria | E15-009 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium without phenol red (D-MEM) | PAA, Austria | E15-047 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA, Austria | A15-151 | |
| L-Glutamine | PAA, Austria | M11-004 | |
| PBS | PAA, Austria | H15-002 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA, Austria | P11-010 | |
| WillCo-dish® Glass bottom dish (35 mm ∅, #1.5) | WillCo Wells, Netherlands | GWSt-3522 | |
| CELLviewTM glass bottom dish, 35 mm | Greiner Bio one, Germany | 627871 | Alternative: Available as segmented |
| Carboxylated latex microspheres | Polysciences, USA | #09850 | Available in different diameters, we used 3 μm |
| Polystyrene microparticles | Kisker Biotech, Germany | PPs-3.0COOH | |
| Triton-X 100 | ROTH, Germany | 305.1.3 | |
| mouse whole IgG | Rockland, USA | 010-0102 | |
| EDAC crosslinker | Sigma-Aldrich, USA | E6383-1g | |
| 10 mM Tris | Sigma-Aldrich,USA | T1503 | |
| 1-ml syringe Omnifix -F | B.Braun, Germany | 9161406V | |
| 26 G needle (0.45*25 mm) | B.Baun, Germany | 4657683 | |
| RPMI 1640 | PAA, Austria | E15-039 | |
| Horse Serum | Gibco, USA | 16050-122 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich, USA | M2933 | |
| 0.2 μM syringe mounted filter | Sartorius, Germany | 83.1826.001 |
Riferimenti
- Greenberg, S., Grinstein, S. Phagocytosis and innate immunity. Curr. Opin. Immunol. 14, 136-145 (2002).
- Jutras, I., Desjardins, M. Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 511-527 (2005).
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science. 327, 291-295 (2010).
- Stuart, L., Ezekowitz, R. Phagocytosis: elegant complexity. Immunity. 22, 539-550 (2005).
- Blander, J. M., Medzhitov, R. On regulation of phagosome maturation and antigen presentation. Nat. Immunol. 7, 1029-1035 (2006).
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu. Rev. Pathol. 7, 61-98 (2012).
- Vieira, O. V., Botelho, R. J., Grinstein, S. Phagosome maturation: aging gracefully. Biochem. J. 366, 689-704 (2002).
- Haas, A. The phagosome: compartment with a license to kill. Traffic. 8, 311-330 (2007).
- Flannagan, R. S., Cosio, G., Grinstein, S. Antimicrobial mechanisms of phagocytes and bacterial evasion strategies. Nat Rev Microbiol. 7, 355-366 (2009).
- Luzio, J., Pryor, P., Bright, N. Lysosomes: fusion and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 622-632 (2007).
- Huotari, J., Helenius, A. Endosome maturation. EMBO J. 30, 3481-3500 (2011).
- Luzio, J. P., et al. Lysosome-endosome fusion and lysosome biogenesis. J. Cell. Sci. 113 (pt 9), 1515-1524 (2000).
- Eissenberg, L., Goldman, W. Fusion of lysosomes with phagosomes containing Histoplasma capsulatum: use of fluoresceinated dextran). Adv. Exp. Med. Biol. 239, 53-61 (1988).
- de Souza Carvalho, C., et al. Internalization, phagolysosomal biogenesis and killing of mycobacteria in enucleated epithelial cells. Cell. Microbiol. 13, 1234-1249 (2011).
- Wang, Y. L. Differential and sequential delivery of fluorescent lysosomal probes into phagosomes in mouse peritoneal macrophages. J. Cell Biol. 104, 1749-1754 (1987).
- Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. Phagosomes Fuse with Late Endosomes and/or Lysosomes by Extension of Membrane Protrusions along Microtubules: Role of Rab7 and RILP. Mol. Cell. Biol. 23, 6494-6506 (2003).
- Huynh, K. K., et al. LAMP proteins are required for fusion of lysosomes with phagosomes. EMBO J. 26, 313-324 (2007).
- Kasmapour, B., Gronow, A., Bleck, C., Hong, W., Gutierrez, M. Size-dependent mechanism of cargo sorting during lysosome-phagosome fusion is controlled by Rab34. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 20485-20490 (2012).
- Snijder, B., et al. Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection. Nature. 461, 520-523 (2009).
- Knight, M., Roberts, S., Lee, D., Bader, D. Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284, 9 (2003).
- Hemmi, H., et al. A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA. Nature. 408, 740-745 (2000).
- Underhill, D., Ozinsky, A. Toll-like receptors: key mediators of microbe detection. Curr. Opin. Immunol. 14, 103-110 (2002).
- Bohdanowicz, M., Cosío, G., Backer, J., Grinstein, S. Class I and class III phosphoinositide 3-kinases are required for actin polymerization that propels phagosomes. J. Cell Biol. 191, 999-1012 (2010).
- Hoffmann, E., et al. Initial receptor-ligand interactions modulate gene expression and phagosomal properties during both early and late stages of phagocytosis. Eur. J. Cell Biol. 89, 693-704 (2010).
- Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. The kinetics of phagosome maturation as a function of phagosome/lysosome fusion and acquisition of hydrolytic activity. Traffic. 6, 413-420 (2005).
- Savina, A., et al. NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells. Cell. 126, 205-218 (2006).
- Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. Recording phagosome maturation through the real-time, spectrofluorometric measurement of hydrolytic activities. Methods Mol. Biol. 531, 157-171 (2009).
- Russell, D., Vanderven, B., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function. Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).
- Hoffmann, E., et al. Autonomous phagosomal degradation and antigen presentation in dendritic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14556-14561 (2012).
- Tan, S., Sukumar, N., Abramovitch, R., Parish, T., Russell, D. Mycobacterium tuberculosis Responds to Chloride and pH as Synergistic Cues to the Immune Status of its Host Cell. PLoS Pathog. 9, (2013).
- Aziz, M., Yang, W. -. L., Wang, P., Coliganet, J. E. Measurement of phagocytic engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Current protocols in immunology. 14, (2013).
- Rogers, L., Foster, L. The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 18520-18525 (2007).
- Russell, D. G., Vanderven, B. C., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. S. The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function. Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).
- Savina, A., Vargas, P., Guermonprez, P., Lennon, A. -. M., Amigorena, S. Measuring pH, ROS production, maturation, and degradation in dendritic cell phagosomes using cytofluorometry-based assays. Methods. Mol. Biol. 595, 383-402 (2010).
