Sintesi di una proteina artificiale mediata da inteina Hydrogel

Sommario

Presentiamo la sintesi di un idrogel split-mediata da inteina proteina. Le componenti di questo idrogel sono due copolimeri proteine ​​contenenti ciascuno una subunità di una proteina trimeric che funge da reticolante e una metà di una inteina scissione. Miscelazione dei due copolimeri proteina innesca una reazione trans-splicing inteina, ottenendo una unità polipeptide che autoassembla in un idrogel. Questo idrogel è altamente pH e temperatura stabile, compatibile con solventi organici, e facilmente incorpora proteine ​​globulari funzionali.

Abstract

Presentiamo la sintesi di una proteina idrogel altamente stabile mediata da uno split-inteina catalizzata reazione proteina trans-splicing. Le componenti di questo idrogel sono due blocchi copolimeri proteine ​​contenenti ciascuno una subunità di una proteina trimeric che funge da reticolante e una metà di una inteina scissione. Una bobina casuale altamente idrofila viene inserito in uno dei blocchi copolimeri per la ritenzione idrica. Miscelazione dei due copolimeri a blocchi proteina innesca una reazione trans-splicing inteina, ottenendo una unità polipeptide con reticolanti alle due estremità che rapidamente auto-assembla in un idrogel. Questo idrogel è molto stabile sia in condizioni acide o basiche, a temperature fino a 50 ° C, e in solventi organici. L'idrogel rapidamente riforme dopo la rottura shear-indotta. Costituzione di una "docking station peptide" in blocco dell'edificio idrogel permette conveniente incorporazione di "aggancio proteina"-tagged proteine ​​bersaglio.L'idrogel è compatibile con mezzi di crescita di coltura tissutale, supporta la diffusione di molecole 20 kDa, e consente l'immobilizzazione di proteine ​​globulari bioattivi. L'applicazione del idrogel proteine ​​mediata da inteina come biocatalizzatore compatibile organico-solvente è stato dimostrato incapsulando l'enzima perossidasi di rafano e corroborare la sua attività.

Introduzione

Gli idrogel interamente in proteine ​​portano il potenziale per far avanzare in modo significativo campi diversi come l'ingegneria dei tessuti, somministrazione di farmaci e biofabrication ^1. Essi offrono vantaggi rispetto ai tradizionali idrogel polimerici sintetici, tra cui biocompatibilità e la possibilità di sostenere in modo non invasivo l'incorporazione di proteine ​​globulari bioattive.

In questo lavoro, si descrive lo sviluppo di una proteina idrogel romanzo formata tramite split-mediata da inteina reazione proteina trans-splicing e la sua applicazione come impalcatura immobilizzazione di proteine ​​(Fig....

Protocollo

1. Plasmide Costruzioni

NOTA: Tutti i geni sono stati amplificati in reazioni di PCR standard utilizzando Phusion-High Fidelity DNA Polymerase secondo le specifiche del produttore. Primer utilizzati per il clonaggio sono stati descritti in precedenza ^9. Tutti i costrutti sono elencati nella Tabella 1.

1. Per generare Cuta-NpuN (N, Tabella 1):
   1. PCR amplifica Cuta e NpuN geni da plasmidi PET30-Cuta-Tip1 ¹⁰ e kanr-IntRBS-NpuNC-CFN ^11, rispettivamente, utilizzando i primer appropriati.
   2. Digerire questi frammenti con gli appropriati enzimi di restrizion....

Risultati

Uno schema per mediata da inteina formazione proteica idrogel è presentato nella Figura 1A. Gli elementi costitutivi del idrogel sono la proteina copolimeri Cuta-NpuN (N) e NpuC-S-Cuta (C) (Figura 1A, Tabella 1). NpuN / C sono i N-/C-fragments del DnaE naturalmente inteina suddivisa da Nostoc punctiforme (Npu). Cuta è una proteina trimeric stabile da Pyrococcus horikoshii ^4,5. Miscelazione di purificato N e C in presenza dell'agente riducente DTT induce la formaz.......

Discussione

In questo lavoro, abbiamo dimostrato la sintesi di un altamente stabile mediata da inteina idrogel proteina. L'uso di una scissione consente inteina l'idrogel essere condizionale formata in risposta alla miscelazione dei due componenti in fase liquida. In particolare, la scissione collega inteina covalentemente due blocchi in fase liquida tramite una reazione di trans-splicing, producendo una unità polipeptide fiancheggiato da reticolazione unità che a sua volta sé ​​assembla in un idrogel. La formazion.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltà	New England BioLabs	M0530S
Competente Escherichia coli BL21 (DE3)	New England BioLabs	C2527I
Luria Bertani	VWR	90003-350
Bacto Agar Media	VWR
Kanamycin sulfate	VWR
IPTG	VWR	EM-5820
Imidazolo	VWR	EM-5720
Urea	VWR	EM-9510
Ditiotreitolo (DTT)	Fisher	BP172-5
Cocktail di inibitori della proteasi	Roche Applied Science	11836153001
DPBS	VWR	82020-066
Brilliant Blue R	Acros Organics	A0297990
Sodium Azide	Fisher	AC190380050	Attenzione, altamente tossico
Perossidasi di rafano	Sigma	P8125-5KU
N,N-dimetil-p-fenilendiammina	Fisher	AC408460250	Attenzione, altamente tossico
fenolo	Fisher	AC149340500	Attenzione, altamente tossico
terz-butile idroperossido	Fisher	AC180340050	Attenzione, altamente tossico
n-eptano	Acros Organics	120340010
[header]
Shaker/Incubator	Fisher Scientific	Max Q 6000
Centrifuga	Sorvall	RC 6
Sonicator	QSonica	Misonix 200
Provette per ultrafiltrazione	Amicon Ultra	UFC903024
Colonna HisTrap ad alte prestazioni Ni Sepharose	GE Healthcare Life Sciences	17-5248-01
HiTrap SP Sepharose FF colonna a scambio ionico	GE Healthcare Life Sciences	17-5156-01
Plate reader	Molecular Devices	SpectraMax Gemini EM