Transient proteinproduktion i Nicotiana anläggningar baserade på vakuum infiltration med Agrobacteria bär lanserings vektorer (tobak viruset baserat) är en snabb och ekonomisk metod för att framställa vaccinantigener och terapeutiska proteiner. Vi förenklat förfarandet och förbättrat mål anhopning genom att optimera betingelser bakterieodling, välja värdart, och co-införa RNA tysta suppressorer.
Agrobacterium-medierad transient proteinproduktion i växter är en lovande metod för att framställa vaccin-antigener och terapeutiska proteiner inom en kort tidsperiod. Dock är denna teknik bara börjat tillämpas på storskalig produktion så många tekniska hinder för att skala upp är nu övervinnas. Här visar vi en enkel och reproducerbar metod för industriell skala transient proteinproduktion baserad på vakuum infiltration av Nicotiana växter med Agrobacteria bär lanserings vektorer. Optimering av Agrobacterium-odlingen i AB-medium möjliggör direkt utspädning av bakteriekulturen i Milli-Q-vatten, vilket förenklar infiltrationsprocessen. Bland tre testade arter av Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior) valdes som den mest lovande värd på grund av den lätthet med infiltration, hög reporter proteinproduktion, och cirka två-fgamla högre biomassaproduktion under kontrollerade miljöförhållanden. Induktion av Agrobacterium hysande pBID4-GFP (tobaksmosaikvirus-baserade) med användning av kemikalier såsom acetosyringon och monosackarid hade ingen effekt på proteinets produktionsnivå. Infiltrera växt i 50 till 100 mbar till 30 eller 60 sekunder resulterade i cirka 95% infiltration av växtbladvävnad. Infiltration med Agrobacterium laboratoriestammen GV3101 visade den högsta proteinproduktionen jämfört med Agrobacteria laboratoriestammar LBA4404 och C58C1 och vildtyp Agrobacteria stammar AT6, AT10, at77 och A4. Co-uttryck av en virus-RNA som tystar suppressor, p23 eller p19, i N. benthamiana ledde tidigare ackumulation och ökad produktion (15-25%) av målprotein (influensavirushemagglutinin).
Växter är nu erkänd som en säker, pålitlig, skalbar och billig plattform för att producera heterologa rekombinanta proteinläkemedel och industri proteiner 1-3 och har viktiga fördelar jämfört med mikrobiella och animaliska cellexpressionssystem 4. Växter kan uttrycka korrekt veckade proteiner med post-translationella modifieringar, inklusive sammansatta multimera antikroppar 5-7. Flera vegetabiliska rekombinanta farmaceutiska proteiner genomgår klinisk utvärdering 8. Dessa inkluderar patientspecifika rekombinanta idiotypa vacciner (scFv) för behandling av non-Hodgkins lymfom 9, hemagglutinin baserad pandemi och vaccin mot säsongsinfluensa kandidater 10,11 (Cummings et al., In till vaccin), anti-Streptococcus ytantigen I / II-antikropp för behandling av tandkaries 12 och humant insulin för behandling av diabetes 13. Vidare humant recombinant glukocerebrosidas för enzymersättningsterapi hos patienter med Gauchers sjukdom har godkänts i Israel och USA och finns under Expanded Access Program utanför USA 14,15.
Heterologa proteiner kan produceras i stabilt transformerade (transgen eller transplastomic) eller transient transformerade växter. Transient proteinproduktion erbjuder flera fördelar jämfört med produktion i transgena växter, inklusive kort tidsram för att uppnå uttryck och ackumulering 16, och kan uppnås genom att införa bakteriella binära vektorer eller rekombinanta växt virala vektorer i växtvävnader 4. Den mest avancerade övergående expressionssystem är baserat på användningen av "uppskjutnings vektorer 'som kombinerar komponenterna av växtvirus och binära plasmider, och levereras av agroinfiltration 17,18. Agroinfiltration av en lanserings vektor baserad på tobaksmosaikvirus (TMV) har med framgång tillämpats på labskala för att framställa vaccinantigener mot patogener som humant papillomvirus 19, Yersinia pestis 20, influensavirus A 21,22, Bacillus anthracis 23, och smittkoppsvirus 24 i N. benthamiana leaves. Agrobacterium-medierad transient expression är också en lovande metod för samtidig produktion av flera proteiner 2,25-27. Till exempel har växt övergående expressionssystem använts för att producera tumörspecifika rekombinanta antikroppar 28,29, ett glykosylerat rekombinant antikropp mot epidermal tillväxtfaktorreceptor 30, och en monoklonal antikropp specifik för mjältbrand skyddande antigen 31,32. Co-infiltration av Nicotiana benthamiana växter med en målgen och en suppressor av genen som tystar ger förbättrad målprotein uttryck 33,34.
Agroinfiltration är en vanlig metod för att likformigt introsiering bakterier som hyser en gen av intresse i växtvävnader 35-37. Vakuum infiltration av Agrobacterium för transient genuttryck i intakta växtblad är en snabb, skalbar och användbar metod för produktion av främmande proteiner utan behov att alstra transgena växter 38-41. Under vakuum agroinfiltration, är växter vänt upp och ned och antenn delar nedsänkta i Agrobacterium upphängning. Då vakuum appliceras orsakar gaser att evakuera från bladintercellulära utrymmen genom klyvöppningar. Snabb återtrycksättning efter utsläpp av vakuumresulterar i infusion av Agrobacterium-suspension in i bladet. Efter vakuum infiltration av Agrobacteria, är växter ytterligare odlas och mål uttryck övervakas. De högsta nivåerna av mål-uttrycket är vanligtvis observeras 2-3 dagar efter infiltration (dpi) med en binär vektor och 4-7 dpi med en lansering vektor, varefter uttrycket nivån vanligtvis decreaSES 17,18,42-45. Agrobacterium tumefaciens är den mest använda fordon för att leverera en gen av intresse i en växt för proteinproduktion. Agroinfiltration fungerar utomordentligt bra i N. benthamiana men relativt dåligt i de flesta andra växter, inklusive Arabidopsis thaliana 46.
I denna studie har vi utvecklat en enkel, effektiv och ekonomisk metod för transient proteinproduktion i 5-6 veckor gamla N. benthamiana använder A. tumefaciens infiltration. Den största nackdelen med industriell skalning av agroinfiltration tekniken är centrifugering av skördade bakterier och återsuspension av den bakteriella pelleten i medium innehållande 4'-hydroxi-3 ', 5'-dimetoxiacetofenon (acetosyringon), monosackarider, och 2 – (N-morfolino) -etansulfonsyra (MES) buffert för induktion av vir-gener. Vi har kunnat lösa dessa problem genom att optimera Agrobacterium </em> tillväxt i AB-medium (minimalt medium), följt av direkt utspädning i Milli-Q-vatten och genom styrning av infiltrationen varaktighet och förhållanden. Vi har också jämfört målprotein produktionen i vildtyp tobak värdarter N. benthamiana och N. excelsior, samt i hybrid N. excelsiana.
I denna studie har vi utvecklat en enkel agroinfiltration protokoll för rutin transient proteinproduktionen i vissa Nicotiana art med användande av Agrobacterium-stammar som bär lanseringen vektor. Dessutom har vi identifierat de optimala förutsättningar för att uppnå högsta rekombinanta proteinproduktionsnivån i vår övergående växtexpressionssystem.
Vakuum infiltration av den utspädda A. tumefaciens stam GV3101 hyser lanseringen vektor pBID4 i N. benthamiana, N. excelsiana och N. excelsior resulterade i högre nivåer av mål-proteinproduktion inom 7 dpi jämfört med andra växtarter, såsom Pisum sativum infiltreras med GV3101 hysande alfalfamosaikvirus – eller gurkmosaikvirus baserade vektorer som uttrycker GFP-reportergenen under 35S-promotorn 41 eller Lactuca sativa, Solanum Lycopersicum och Arabidopsis thaliana infiltreras med C58C1 stam av A. tumefaciens som bär beta-glukuronidas reporter gen 57. N. benthamiana och N. excelsiana var lätta att dammsuga infiltrera på 50 mbar för 30-60 sek, med 90-95% infiltration effektivitet. De återstående 5-10% av bladytan var inte infiltreras på grund av någon flyt av blad på ytan av det Agrobacterium-suspension under applicering av vakuum. Sedan lanseringen vektorn har förmåga för cell-till-cellrörelse 18, uppstår övergående protein ackumulering i hela blad samt bladskaft vid 7 dpi. Vid 10 dpi, den beräknade GFP produktionen var något lägre på grund av att pBID4 expressionsvektor kan röra sig från cell till cell, men inte röra system 18; Därför behöver nya odlade blad innehåller inte vektorn och inte bidrar till produktionen av målet. Dessutom nedbrytning av det rekombinanta proteinet med tiden may bidra till minskad proteinnivå på 10 dpi. Våra resultat visade att infiltrering av A. tumefaciens-stammen GV3101 förmedlade höga nivåer av övergående proteinproduktion i N. benthamiana. Vidare kan målproteinet vara konstruerad som N-terminala, C-terminala eller interna fusioner till likenas (LicKM), β-1 ,3-1 ,4-glukanas, som är ett värmestabilt enzym från Clostridium thermocellum och ger värmestabilitet till många mål proteinfusion 18. Infiltration av N. benthamiana med A. tumefaciens vildtyp stammar (AT6, AT10 och at77) hyser genen av intresse framkallade milda eller allvarliga symtom: blad curling, bladskaft töjning, och curling. Inga patologiska symptom observerades i N. benthamiana infiltrerade med laboratoriestammen GV3101 hyser tom pBID4 vektor, medan vissa gener in i pBID4 och omvandlas till laboratoriestammar GV3101, C58C1 eller LBA4404 framkallade milda nekrotiska svar och lövkloros / gulnande symptom i infiltrerade regioner av löv. Nekrotiska symptom orsakade av vildtyp Agrobacterium eller avväpnade stammar i Solanaceae växter har tidigare 56,57 rapporterats. Den nekrotiska svar skulle kunna resultera från virulensfaktorer från typ III-sekretionssystemet, bakteriella proteiner som överförs till växtcellen genom typ IV sekretionssystemet, och / eller känslighet för flagellin 58-60. Vi har funnit att övergående produktion av heterologa proteiner också kan framkalla patogenicitet och en överkänslig reaktion på infiltrerade blad. Många forskare rapporterade att agroinfiltration av olika växtarter med växt binära vektorer produceras upp till 5-20 gånger högre nivåer av övergående proteinproduktion jämfört med stabilt transformerade växter 28,57. Våra data visar att N. benthamiana infiltrerade med GV3101 hysande pBID4-GFP uttrycktes transient höga nivåer av GFP, vilket liknar GFP utbyte rapporteras förN. benthamiana infiltrerade med Agrobacteria bär Pich-GFPSYS virusvektor (upp till 80% av den totala lösligt protein) 44. Agroinfiltration använda vår lansering vektorn gav hög produktion av det termostabila proteinet LicKM, 50-faldigt högre än den som observerades med användning av en vanlig binär plasmid 18.
För att testa smittsamhet av A. tumefaciens och stabiliteten i lanseringen vektor, infiltrerade vi en platta av N. benthamiana varje timme i upp till 8 h med användning av samma Milli-Q-vatten-utspädda kultur av GV3101 härbärgerar den pBID4-GFP plasmid. Våra data visade att GV3101 stammen effektivt smitt i minst 8 timmar och pBID4 (lanseringen vektor) är mycket stabil under 8 timmar långa infiltration.
Glycerol lager av GV3101 stam härbärge lanseringen vektorn pBID4-HAC1 (cellbank) förvaras vid -80 ° C har visat sig vara mycket stabil i tre år utan förändringar i övergående protei produktion i infiltrerade växter.
N. benthamiana växter som odlas under optimala förhållanden och mellan 35 och 42 dagar efter sådd var optimala för vakuuminfiltrering-medierad transient genuttryck 40. Yngre växter (3-4 veckor) kan inte infiltreras i sin helhet på grund av löv som flyter på cellsuspensionsytan och vävnadsskada från de mekaniska effekterna av att tillämpa ett vakuum. I anläggningar som är äldre än 45 dagar, N. benthamiana bultning skede under optimala ljusförhållanden som används, är den nivå av övergående uttryck låg.
Lågmolekylära fenolföreningar (acetosyringone) och monosaccharaides (glukos) är kända för att inducera vir-gener i A. tumefaciens 55,61. Dessutom infiltration av N. benthamiana med den binära vektorn pCAMBIA (GFP) i närvaro av acetosyringon vid koncentrationer av 50-600 | iM visade sig öka något övergåendegenuttryck 40. Vi studerade effekten av olika koncentrationer av acetosyringon och glukos i vårt system genom att lägga till dessa föreningar till GV3101 kulturer hyser pBID4-GFP i MMA i 3 timmar, och fann ingen skillnad i GFP uttryck. Intressant GV3101 kulturer hyser pBID4-GFP och efter utspädning i Milli-Q-vatten till en A 600 på 0,5 och infiltrerade utan vir geninduktion uttryckte samma mängder av GFP som de infiltrerade med inducerade kulturer. Den A. tumefaciens vir-genen (s) skulle kunna induceras av växtfenolföreningar (acetosyringone och sinapinsyra) och växt monosaccharaides (glukos och fruktos) som finns i bladvävnad. Därför kan vi spekulera i att liknande nivåer av GFP-uttryck i närvaro eller frånvaro av exogena vir-genprodukter inducerare kan vara ett resultat av verkan av cytoplasmatiska vir-genprodukter inducerare närvarande under replikation av GFP-uttryckande lanseringen vektorn i växtceller.
<p class= "Jove_content"> Wild-typ N. benthamiana har använts som en modell värd för transient proteinproduktion 49. Men N. benthamiana s relativt låga avkastning biomassa hindrar sin ansökan om storskalig produktion av rekombinanta proteiner. Den optimala värden bör kombinera en hög nivå av övergående uttryck, lätt tillväxt i ett växthus, och vara mottagliga för Agrobacterium infiltration 2. För att välja en alternativ värd, vi infiltrerade två olika vildtyp arter av Nicotiana (N. benthamiana och N. excelsior) och en hybrid N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior) med A. tumefaciens stam GV3101 härbärgerar pBID4-GFP plasmid. Bland dessa tre arter, nivån av GFP uttryck var något högre i N. benthamiana. N. excelsior växter visade svårighet vakuum agroinfiltration grund av sina läderartade blad, och N. excelsianaproduceras cirka två gånger mer biomassa på samma villkor tillväxt. Den övergående produktionen av GFP vid 7 dpi är relativt lika i N. benthamiana och N. excelsiana. Därför, N. excelsiana kan vara en mer lämplig värd för rekombinant proteinproduktion.Agrobacterium-medierad transient proteinproduktion är begränsad av PTGS 26, som kan övervinnas genom samexpression av geners suppressorer av växtvirus ursprung 62. Transient proteinproduktion har tidigare visats att ökas 50-faldigt i närvaro av p19-protein av TBSV, som hämmar PTGS i infiltrerade vävnader 34. I vår studie, bedömde vi effekten av två virustyst dämpning (P19 och P23) separat co-infiltrerade med lanseringen vektorn pBID4-HAC1. Samtidig infiltration av dessa tysta dämpare verkade ha lite inflytande på gående uttryck av HAC1, med endast en liten ökning i HAC1proteinackumulering (15-25%) i närvaro av co-infiltrerade p23 eller p19. För att positivt påverka proteinproduktion, kan tysta dämpare måste vara särskilt utvalda för att vara effektivt för de berörda växtarter och virusvektor 63. TMV helikas har en suppressor av RNA som tystar aktivitet 64,65. Våra data bekräftar denna observation som co-infiltration av p23 eller p19 med pBID4-HAC1 gav ingen ökning av GFP eller en liten ökning av övergående HAC1 proteinproduktion.
Sammanfattningsvis har vi modifierat och optimerad anläggning och Agrobacterium tillväxtförhållanden och effektiviserat vakuum infiltration. Denna teknik det möjligt för oss att växa och infiltrera hundratals kilo växtmaterial inom några timmar. Vi framgångsrikt automatiserat anläggningen gående uttryck teknik för hög genomströmning vaccinproduktionen vid industriella skalor enligt nuvarande Good Manufacturing Practices (cGMP) villkor. För mer information aboUT automation och användning av anläggningen övergående proteinproduktionssystem för produktion av rekombinanta proteiner, inklusive subenhet vaccinkandidater, under cGMP förhållanden, är läsarna hänvisas till webbplatsen www.fhcmb.org/ .
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Fraunhofer USA Centrum för Molekylär Bioteknik, Ibio, Inc. och Defense Advanced Research Projects Agency (bidrag # HDTRA1-07-C-0054). Författarna erkänner de generösa gåvor av Dr. Stanton Gelvin of Biological Science Dept, Purdue University (Agrobacterium tumefaciens stammar) och Wayne Fitzmaurice av Large Scale Biology Corp (N. excelsiana frön), liksom Jennifer Nicholson of US Nicotiana Collection, North Carolina State University (N. excelsior frön ). Författarna tackar Margaret Shillingford och Christopher Hull för att ge växter och utmärkt tekniskt stöd. Författarna tackar också Dr. Stephen Streatfield och Natasha Kushnir för redaktionell hjälp.
Nicotiana benthamiana | Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University | PI 555478 TW16 | Infiltration |
Nicotiana excelsior | Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University | PI 555685 TW47 | Infiltration |
Nicotiana excelsiana | Dr. Wayne Fitzmaurice, Large Scale Biology Corporation, Vacaville, CA | LSBC EBA 042304.02 | Infiltration |
Vacuum skid | Abbas, Ashland, MA | Custom made | Plant infiltration |
Rockwool | Grodan Inc., Ontario, Canada | AO 50/40 | Hydroponic media for growing plant |
2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid | Acros Organics, Thermo Fisher Scientific NJ |
172595000 | Buffer |
Murashige & Skoog salt (MS salt) | Phyto Technology Lab | M524 | Tissue culture media |
Acetosyringone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D134406-5G | Agrobacterium induction |
Immobilon-P transfer membrane | Millipore, Billerica, MA | IPVH00010 | Western blotting |
I-block | Applied Biosystems, Foster City, CA | T2015 | Western blotting |
Rabbit polyclonal anti-GFP antiserum | Washington Biotechnology, Baltimore, MD | Western blotting | |
Mouse anti–poly-histidine monoclonal antibody | Qiagen GmbH, Hilden | 34670 | Western blotting |
Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit antibody | Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA | 111-035-003 | Western blotting |
Horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse antibody | Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA | 115-035-003 | Western blotting |
SuperSignal® West Pico chemiluminescent substrate | Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL | 34078 | Western blotting |
Lichenan (1-3: 1-4-beta-D-glucan) | Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland | P-LICHN | Lichenase Activity |
Congo Red | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | C6277 | Gel staining |
Digital camera | Olympus, Center Valley, PA | C-8080 | Chemiluminescence imaging |
GeneGnome | Syngene, Frederick, MD | Chemiluminescence imaging | |
GFP standard | Made in house | Chemiluminescence imaging | |
Plant fertilizer solution | Griffin Greenhouse & Nursery Supplies, Newark, DE | 67-23-20 | Plant growing |
Lichenase Standard | Purified in house | Western blotting | |
MicroPulser Electroporator | BioRad, Hercules, CA | 165-2100 | Agrobacterium transformation |