Kindlins er grundlæggende for celle adhæsion gennem integriner men undersøgelser af dem har været hæmmet af vanskeligheden ved at udtrykke dem rekombinant i bakterielle værter. Vi beskriver her metoder til deres effektive produktion i baculovirus-inficerede insektceller.
Kindlins er væsentlige coaktivatorer med Tallinn, af celleoverfladereceptorerne integriner og også deltage i integrin outside-in signalering og kontrol af gen-transkription i cellekernen. De kindlins er ~ 75 kDa Multidomain proteiner og binde til et NPxY motiv og opstrøms T / S klynge af integrin β-underenhed cytoplasmatiske hale. Det hematopoietically vigtige kindlin isoform, kindlin-3, er afgørende for trombocytaggregation under trombedannelse, leukocyt rullende i respons på infektion og inflammation og osteoclast podocyte dannelse i knogleresorption. Kindlin-3 rolle i disse processer har resulteret i omfattende cellulære og fysiologiske studier. Der er imidlertid et behov for en effektiv metode til at erhverve høj kvalitet milligram mængder af det protein, for yderligere undersøgelser. Vi har udviklet en protokol, der er beskrevet her, til effektiv ekspression og oprensning af rekombinant murin kindlin-3 ved anvendelse af en baculovirus-dsønderrevet ekspressionssystem i Sf9-celler, der giver tilstrækkelige mængder af høj renhed fuldlængde-proteinet for at tillade biofysisk karakterisering. Samme fremgangsmåde kunne tages i studiet af de andre pattedyr kindlin isoformer.
Proteiner af kindlin familien er en afgørende komponent af fokal vedhæftning forsamling, og derfor afgørende for komplekst liv. Kindlins, hvoraf der er 3 isoformer af pattedyr (kindlin-1, kindlin-2 og kindlin-3), betragtes som coaktivatorer af den ekstracellulære receptorer integrinerne sammen Tallinn 1. Integrin-medieret celleadhæsion forbinder celleoverfladen til den ekstracellulære matrix (ECM) i højere eukaryoter. Det er et kritisk og fælles proces i et væld af fysiologiske fænomener, som omfatter væv integritet, embryogenese knoglemetabolisme, hæmostase og immunitet. Integrin-medieret celleadhæsion aktiveres via inside-out signaltransduktion via bindingen af talin og kindlin til integrin β-underenhed cytoplasmatiske haler (CTS) ved deres konserverede NPxY motiver. Den biomedicinske betydning kindlin proteiner strækker dog så langt som kernen, hvor kindlin-2 er blevet vist i adskillige nylige rapporter at være involveret i transkriptional kontrol 2,3.
Kindlins er Multidomain proteiner på ca 75 kDa, stemplet af besiddelse af et todelt C-terminal FERM (4,1 band, ezrin, radixin, moesin) domæne, som er afbrudt af en pleckstrin homologi (PH) domæne i centrum for sin F2 subdomæne 4,5. Undersøgelser af kindlin-2 og kindlin-3 PH-domæner viste, at det binder til lipid-second messengers phosphotidylinositol-(3,4,5)-triphosphat og phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphat 6-8. , Undersøgelser af kindlin-1 PH domæne viser dog, at det binder sig til PtdIns (3,4,5) P 3 med en meget lavere affinitet, som kan forklares i kindlin-1 ved en isoform-specifik salt bro forhindrer lipider binde 9.. Derudover er der et ~ 100 aminosyre løkke indsættes i F1 domæne af kindlins, der forudsiges at blive udfoldet, men binder til phosphatidylserin i det indre blad af plasmamembranen 10,11. Den kindlin FERMdomæne anses homolog med talin FERM domæne, selvom talin FERM domænet ikke har et pleckstrin-homologidomæne. Både kindlins og talin interagere med NPxY motiver på integrininhiberende β-haler via F3-regionen i deres FERM domæne, men kindlin binder til membranen distale motiv, mens Tallinn målretter membranproksimale en 12-16. Kindlins og talin både Desuden besidder en N-terminal F0 domæne med et ubiquitin-lignende fold, der ikke findes i andre Ferm proteiner 11,17. Undersøgelser af F0 domæne kindlin-2 har vist, at det selvstændigt binder sig til phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphatniveauer beriget membraner 17.
De kindlins udviser paralog-specifikke vævsekspression mønstre og nonredundant fysiologiske funktioner. Kindlin-1 udtrykkes primært i epidermis, men også i mindre grad i tyktarmen, maven og nyrerne, kindlin-2 udtrykkes ubikvitært, men er koncentreret i tværstribet og glatmuskel og er den eneste kindlin udtrykt i fosterudviklingen 4 og kindlin-3 udtrykkes i de bloddannende væv med den højeste koncentration af kindlin-3 findes i megakaryocytter 18. Imidlertid har nyere undersøgelser antydet, at funktionelt protein udtrykkes i endotelvæv samt 19.
Kindlin-3 er af akut medicinsk interesse på grund af sin vigtig fysiologisk rolle i blodet. Det er afgørende for blodpladeaggregering og spredning i thrombedannelse 20 leukocyt rullende som reaktion på infektion og inflammation 21,22 og osteoklast podocyte dannelse i knogleresorption 23. Desuden udtømning af kindlin-3 hos mennesker fører til leukocytadhæsionsreceptoren mangel type III – en sygdom karakteriseret ved livstruende blødningsforstyrrelser og recidiverende bakterieinfektioner 20,24,25. Kindlin-3-knock-out undersøgelser i mus afslørede afgørende funktion af proteinet icelleadhæsion KIND3 -. / – mus viser tydelige fænotyper, såsom alvorlig blødning på grund af inaktive trombocyttal integriner, alvorlig osteopetrose og nedsat leukocytadhæsion 20,22, der ligner symptomer hos mennesker mangler kindlin-3.
Høj opløsning strukturelle data om kindlins til dato har været begrænset til enkelte subdomæner såsom pleckstrin homologi (PH) domæne af kindlin-1 9 og kindlin-2 26,27 og F0 domæne kindlin-1 11 og kindlin -2 17.. De fleste af de underdomæner for hver kindlin polypeptid har dog modstået kloning og strukturel analyse (Yates og Gilbert, upublicerede observationer), og undersøgelser af proteiner i fuld længde er blevet hæmmet af vanskeligheder med at udtrykke og rensning tilstrækkelige mængder ved hjælp af E. coli (upublicerede observationer og Harburger et al. 14). Der er betydelig medicinsk interesse i kindlin-3 og dens function, sammen med de to andre familiemedlemmer, og for nylig har vi genereret milligram mængder af det ved rekombinant ekspression i Spodoptera frugiperda-celler drevet af baculovirusinfektion 12. Vi har derfor her beskriver fremgangsmåder til fremstilling af milligram-mængder af rekombinant muse kindlin-3 i insekt cellekultur, der er egnede til omfattende strukturelle undersøgelser og biokemisk analyse.
I denne protokol vi gør brug af en manipuleret knockout bacmid (BAC10 KO: 1629) der er alene, ude af stand til at producere levedygtige virioner 28. Det virale DNA er således reddet ved rekombination med transfer-vektor, som i dette tilfælde omfatter også kindlin-3-genet (FERMT3) og resulterer i FERMT3 genet erstatter virus meget sent gen, som er overudtrykt, men overflødig, hvilket resulterer i et rekombinant virus, der udtrykker muse kindlin-3 som del af virus livscyklus 28. Vi identificerede dettemetode til fremstilling af kindlin-3 efter forsøg på at udtrykke og rense den i andre ekspressionsværter bevist uoverkommeligt vanskeligt (upublicerede observationer), men også på grund af den alsidighed POPIN vektor suite, som vi har brugt til kloning og som kan anvendes i mange udtryk vært 29.
Baculovirusekspressionssystemer bliver stadig mere populære, og et vigtigt redskab til produktion af milligram mængder af rekombinant protein til protein karakterisering ved hjælp af biofysiske undersøgelser, herunder røntgenkrystallografi. På trods af at mere eksperimentelt krævende baculovirusekspressionssystemer tilbyde flere fordele i forhold til E. coli hvoraf den ene er en nær-native miljø for proteiner af eukaryot oprindelse fx tilstedeværelsen af passende chaperoner og mulighed for post-translationel modifikation. I vores egne bestræbelser på at udtrykke kindlin-3 blev alternative ekspressionsværter anvendes, herunder pattedyr cellelinier og bakterielle ekspressionsstammer (upublicerede observationer). Generelt mange E. coli testede stammer produceres meget små mængder af rekombinant kindlin-3 (~ 0,5 mg / l kultur upublicerede observationer). Men baculovirus-drevet ekspression i insektceller var særlig effektiv, og i samarbejdemparison til transient ekspression i pattedyrceller, mere modtagelig for at generere den store biomasse kræves for at isolere et milligram rekombinant cytoplasmatiske proteiner (upublicerede observationer). Vi spekulere i, at tilstedeværelsen eukaryote chaperoner kan tillade effektiv produktion af kindlin-3.
De baculoviridae inficere insektceller og rekombinant protein ekspression baculovirus anvendt i dette arbejde er baseret på Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV). I naturen AcNPV, som inficerer Autographa californica (lucerne grensaks) insektlarver, kræver polyhedrinprotein at danne tillukning hvorved vironer er indkapslet i en krystallinsk protein matrix dermed give den nødvendige beskyttelse af deres løsladelse. I dyrkede celler er ikke påkrævet dannelsen af okklusionslegemer for replikation og er derfor undværes. I tilfælde af at udtrykke fremmede proteiner polyhedrin-protein-gen kan være replaced i en rekombinant AcNPV med genet for proteinet af interesse. AcNPV kan inficere andre Lepidopteron arter og med henblik på rekombinant protein udtryk hær orm Spodoptera frugiperda anvendes puppe ovarieceller. I den her skitserede fremgangsmåde er AcNPV bacmid (BAC10) manipuleret således, at en væsentlig virale gen, ORF1629, inaktiveres ved indsættelse af chloramphenicolacetyltransferase resulterer i en knock-out bacmid (BAC10: KO 1629), således at det er i stand til at danne infektiøse baculovirions 28. Cotransfektion af Sf9-celler med lineariseret BAC10: KO 1629 og FERMT3-holdige transfervektor reparerer inaktive ORF1629 gennem gennemførelse, hvilket resulterer i en levedygtig genom, som også har indarbejdet FERMT3 genet under kontrol af polyhedrinpromotoren 28.
Vi beskriver en oprensningsprotokol til isolering af højrent rekombinant muse kindlin-3 via en three trin kromatografisk fremgangsmåde. De metoder, der anvendes her let kunne anvendes på andre His-mærkede proteiner. Vi ansat en ionbyttertrin til yderligere oprensning kindlin-3, men vi mener, at dette er en yderligere pseudo-affinitetstrin som kindlin-3 besidder et stort antal grundlæggende rester, herunder en poly-lysin strækning inden for sit F1 domæne. Derudover er kindlin-3 anses for at binde til og interagere med den cytoplasmatiske side af plasmamembranen, hvor det fungerer, og derfor har vi forudsige, at klynger af basiske rester, vil gøre det muligt for proteinet at imødegå den negativt ladede membran.
De er beskrevet i oprensningsprotokoller buffere betragtes standard og bruges ofte i strukturel biologi. Den thermofluor assay (figur 5) viser, at kindlin-3 er stabil i de fleste pufferbetingelser pH over 6,0. Dette var især nyttigt og vigtigt for at informere vores eksperimenter, når de studerer kinldin-3: β1A-hale interaktion ved NMR, som viste fremragende spektre ved pH 6,1 med lave koncentrationer af NaCl 12.
Før der kan foretages nogen biofysiske undersøgelse, er det vigtigt at vise, at det rensede protein af interesse faktisk er foldet korrekt og er funktionelt aktiv. I en tidligere publikation har vi vist, at den rekombinante kindlin-3 udtrykt og oprenset ved hjælp af denne fremgangsmåde var en monomer og monodispergeret i opløsning, som vurderet ved gelpermeationskromatografi, dynamisk lysspredning, analytisk ultracentrifugering og lille vinkel røntgenspredning, og var også i stand til at binde og anerkende membran-distale NPxY og opstrøms serin / threonin klynge af β 1A cytoplasmatiske haler 14, hvilket bekræfter, at det opfører sig som det native protein, som er i overensstemmelse med tidligere cellulære og fysiologiske studier 14,20,22. Anvendelsen af et termisk stabilitet assay er en yderligere måde at foreslå the korrekt foldning af et protein af interesse, som ukorrekt foldet protein vil resultere i en høj fluorescens baggrund på grund af eksponerede hydrofobe rester.
Den kindlin familie af proteiner har været genstand for megen opmærksomhed, da deres uventet rolle som væsentlige coaktivatorer af integriner in vivo blev opdaget. Dette har udløst en stor indsats for at udtrykke dem rekombinant og løse deres strukturer. Til dato begrænset succes er blevet rapporteret at udtrykke milligram mængder af fuldlængde rekombinant protein, men vi har her beskrevet anvendelsen af et baculovirus-system, der tillader stor skala ekspression på et niveau, hvor strukturelle studier bliver mulig. Ved at generere store mængder af rekombinant kindlin-3 forventer vi, at dette vil bidrage yderligere undersøgelser af dette protein. Baculovirus-drevet fremgangsmåde og oprensning arbejdsgang beskrives her til rekombinant murin kindlin-3 kan også anvendes til at udtrykke og oprense andre kindlin isoformer, Som også er vanskeligt at udtrykke, og også besidder polylysin-strækninger, og kan yderligere tilpasses til andre cytoplasmiske proteiner, såsom nukleinsyrebindingsproteiner, der undlader at udtrykke bakteriestammer.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Weixan Lu til teknisk bistand i kulturen og vedligeholdelse af Sf9 celle bestande. LAY blev understøttet af en Medical Research Council (MRC) graduate studentship. RJCG var en Royal Society University Research Fellow. The Oxford Division Strukturel Biologi er en del af Wellcome Trust Center for Human Genetik, Wellcome Trust Core Award Grant Number 090532/Z/09/Z.
Sf-900 II serum free media (SFM) 1X liquid | Life Technoligies | 10902-096 | store at 4°C and warm to room temperature before use |
Cellfectin II Reagent | InVitrogen | 10362-100 | Alternatively, GeneJuice transfection (EMD) reagent can be used |
Streptomycin Sulphate (solid) | Melford | S0148 | Sterilise filter (0.22μm filter) before use |
Penicillin G, potassium salt (solid) | Melford | P0580 | Sterilise filter (0.22μm filter) before use |
CELLSTAR Sterile 6-well Culture Plate | Greiner bio-one | 657160 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10100-147 | |
Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8849 | Caution: Protease inhibitors are dissolved in DMSO |
Bovine pancrease deoxyribonuclease (Dnase) I | Sigma | D5025 | |
HisTrap FF (5ml) | GE Heathcare | 17-5286-01 | Requires an Äkta FPLC machine |
HiTrap Heparin (5ml) | GE Heathcare | 17-0407-01 | Requires an Äkta FPLC machine |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units (with Ultracel-50 membrane) | Millipore | UFC905024 | 15ml capacity and a MWCO of 50kDa protein concentrator |