Kindlins er grunnleggende for celle adhesjon gjennom inte men studier av dem har vært hemmet av vanskelighet med å uttrykke dem rekombinant i bakterie verter. Vi beskriver her metoder for deres effektiv produksjon i baculovirus-infiserte insektceller.
Kindlins er essensielle coactivators, og Talin, av celleoverflatereseptorer integriner og deltar også i integrin ute-i signalering og styring av gentranskripsjon i cellekjernen. De kindlins er ~ 75 kDa multidomain proteiner og binder seg til et NPxY motiv og oppstrøms T / S klynge av integrinet β-subenheten cytoplasmatisk hale. Den hematopoietically viktige kindlin isoform, kindlin-3, er kritisk for blodplateaggregering under trombedannelse, leukocytt rulle som reaksjon på infeksjon og inflammasjon og osteoclast podocyte dannelse i benresorpsjon. Kindlin-tre rolle i disse prosessene har resultert i omfattende cellulære og fysiologiske studier. Det er imidlertid et behov for en effektiv metode for å skaffe høy kvalitet milligram mengder av proteinet for videre studier. Vi har utviklet en protokoll, som er beskrevet her, for effektiv ekspresjon og rensing av rekombinant murint kindlin-3 ved bruk av en baculovirus-driven ekspresjonssystem i Sf9-celler, hvorved tilstrekkelige mengder av høy renhet full-lengde protein for å tillate dens biofysiske karakterisering. Den samme tilnærmingen kan bli tatt i studiet av de andre pattedyr kindlin isoformer.
Proteiner av kindlin-familien er en viktig del av fokal adhesjon sammenstillingen, og derfor essensielt for kompleks levetid. Kindlins, hvorav det er tre isoformer hos pattedyr (kindlin-en, kindlin-2, og kindlin-3), anses coactivators av de ekstracellulære reseptorer inte sammen Talin en. Integrin-mediert celle adhesjon forbinder celleoverflaten til den ekstracellulære matriks (ECM) i høyere eukaryoter. Det er en viktig og vanlig prosess i en mengde av fysiologiske fenomener, inkludert vev integritet, embryogenese, beinmetabolismen, hemostase og immunforsvar. Integrin-mediert celle adhesjon aktiveres gjennom innsiden ut signaltransduksjon via bindingen av Talin og kindlin til integrin β-subenheten cytoplasmatiske haler (CTS) på sine bevart NPxY motiver. Den biomedisinske betydning kindlin proteiner strekker seg imidlertid så langt som til kjernen, hvor kindlin-2 har blitt vist i flere nylige rapporter å være involvert i transkripsjonal kontrollere 2,3.
Kindlins er multidomain proteiner på omtrent 75 kDa, hall ved at den besitter en todelt C-terminal FERM (4,1 band, ezrin, radixin, moesin) domene, som er avbrutt av en pleckstrin homologi (PH)-domene om midten av sin F2 underdomene 4,5. Studier av kindlin-2 og kindlin-3 PH domener viste at det binder seg til det andre lipid messengers fosfatidylinositol-(3,4,5)-Trisphosphate og fosfatidylinositol-(4,5)-bisfosfat 6-8. Men studier av kindlin-1 PH domenet viser at det binder seg til ptdins (3,4,5) P 3 med en mye lavere affinitet, som kan forklares på kindlin-en av en isoform-spesifikke saltbroen hindre lipider fra binding 9. I tillegg er det et ~ 100 aminosyre-sløyfe inn i F1 domenet av kindlins som er forutsagt til å foldes ut, men binder seg til fosfatidylserin i den indre paknings av plasmamembranen 10,11. Den kindlin FERMDomenet anses homolog med Talin FERM domene, selv om Talin FERM domene ikke har en pleckstrin homologi-domene. Begge kindlins og Talin samhandle med NPxY motiver på integrin β-haler via F3-regionen i sin FERM domene, men kindlin binder seg til membranen distal motiv, mens Talin mål membranen proksimale en 12-16. Kindlins og Talin både i tillegg har en N-terminal F0 domene med et ubiquitin-lignende fold som ikke er funnet i andre Ferm proteiner 11,17. Studier på F0 domenet av kindlin-2 har vist at det uavhengig binder til fosfatidylinositol-(4,5)-bisfosfat anriket membraner 17.
De kindlins utviser paralogue-spesifikke vev uttrykk mønstre og nonredundant fysiologiske funksjoner. Kindlin-en er hovedsakelig uttrykt i overhuden, men også i mindre grad i kolon, mage, og nyrer; kindlin-2 er ubikvitært uttrykt, men konsentreres i tverrstripet og glattmuskel og er den eneste kindlin uttrykt i embryoutvikling 4, og kindlin-3 blir uttrykt i de hematopoietiske vev med den høyeste konsentrasjon av kindlin-3 finnes i megakaryocytter 18. Imidlertid har nyere studier antydet at funksjonelt protein blir uttrykt i endoteliale vev, så vel 19.
Kindlin-3 er akutt medisinsk interesse på grunn av sin viktige fysiologiske rolle i blod. Det er kritisk for blodplateaggregering og sprer seg ved trombedannelse 20, leukocytt rulle som reaksjon på infeksjon og inflammasjon 21,22 og osteoclast podocyte dannelse i benresorpsjon 23.. Videre uttømming av kindlin-3 hos mennesker fører til leukosyttadhesjon mangel type III – en sykdom karakterisert ved livstruende blødningsforstyrrelser og tilbakevendende bakterieinfeksjoner 20,24,25. Kindlin-3-knock-out studier i mus viste den avgjørende funksjon av proteinet icelle adhesjon KIND3 -. / – mus vise tydelige fenotyper, som alvorlig blødning på grunn av inaktive blodplateinte, alvorlig osteopetrose og nedsatt leukosyttadhesjon 20,22, ligner symptomer hos mennesker mangler kindlin-3.
Høyoppløselige strukturelle data om kindlins, til dags dato har vært begrenset til enkelte underdomener som pleckstrin homologi (PH) domene kindlin-en 9 og kindlin-2 26,27 og F0 domenet kindlin-1 11 og kindlin -2 17. De fleste av de underdomener for hver kindlin polypeptid har imidlertid motstått kloning og strukturell analyse (Yates and Gilbert, upubliserte observasjoner) og studier av full-lengde proteiner har blitt hindret av vanskeligheten med å uttrykke og rensing av tilstrekkelige mengder ved å bruke E. coli (upubliserte observasjoner og Harburger et al. 14). Det er en betydelig medisinsk interesse i kindlin-3 og dens fufunksjons, sammen med de to andre familiemedlemmer, og nylig genererte vi milligram mengder av det ved rekombinant uttrykk i Spodoptera frugiperda celler drevet av baculovirus infeksjon 12. Vi har derfor her beskriver fremgangsmåter for fremstilling av milligram mengder av rekombinant mus kindlin-3 i insektcellekultur, egnet for omfattende strukturelle studier og biokjemisk analyse.
I denne protokollen gjør vi bruk av en konstruert knockout bacmid (BAC10 KO: 1629) som er, selv ikke i stand til å produsere levedyktige virions 28. Den virale DNA er således reddet av rekombinasjon med en overføringsvektor som i dette tilfelle også omfatter kindlin-3-genet (FERMT3) og resulterer i FERMT3 gen erstatter viruset meget sent-genet, som er sterkt uttrykt, men overflødige, noe som resulterer i et rekombinant virus som uttrykker mus kindlin-3 som en del av virus livssyklus 28.. Vi identifiserte dettemetode for produksjon av kindlin-tre etter at forsøk på å uttrykke og rense den i andre ekspresjonsverter bevist uoverkommelig vanskelig (upubliserte observasjoner), men også på grunn av allsidigheten av Popin vektor suite, som vi brukte for kloning og som kan distribueres i mange uttrykk vert 29.
Baculovirus uttrykk systemer blir stadig mer populært og et viktig verktøy for produksjon av milligram mengder av rekombinant protein for protein karakterisering ved hjelp av biofysiske studier, inkludert røntgenkrystallografi. Til tross for at mer eksperimentelt krevende baculovirus ekspresjonssystemer tilbyr flere fordeler fremfor E. coli hvorav den ene er en tilnærmet opprinnelig miljø for proteiner av eukaryot opprinnelse f.eks nærvær av passende anstand og mulighet for post-translasjonell modifikasjon. I vår egen innsats for å uttrykke kindlin-3, ble alternative ekspresjonsverter brukt blant annet pattedyrcellelinjer og bakterie uttrykk stammer (upubliserte observasjoner). Generelt er mange E. coli stammer testet produsert svært små mengder av rekombinant kindlin-3 (~ 0,5 mg / L av kultur, upubliserte observasjoner). Imidlertid baculovirus-drevet ekspresjon i insektceller var særlig effektiv, og i comparison til transient ekspresjon i pattedyrceller, mer mottagelig for å generere den stor biomasse som kreves for å isolere et milligram av rekombinante cytoplasmatiske proteiner (upubliserte observasjoner). Vi spekulerer i at tilstedeværelsen eukaryote anstand kan tillate en effektiv produksjon av kindlin-3.
De baculoviridae infisere insektceller, og for rekombinant protein ekspresjon i baculovirus som brukes i dette arbeidet er basert på den Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV). I naturen AcNPV, som infiserer Autographa californica (alfalfa lopper) insektlarver, krever polyhedrin protein for å danne occlusions hvorved virons er innkapslet i en krystallinsk protein matrise og dermed gi den nødvendige beskyttelse for sin utgivelse. I dyrkede celler dannelse av okklusjonslegemer ikke er nødvendig for replikasjon, og er derfor unnværlig. Ved å uttrykke fremmede proteiner polyhedrin-protein-genet kan være replaced i en rekombinant AcNPV med genet for proteinet av interesse. AcNPV kan infisere andre Lepidopteron arter og i forbindelse med rekombinant protein uttrykk hær orm Spodoptera frugiperda pupal ovarieceller brukes. I metode er beskrevet her, er det AcNPV bacmid (BAC10) konstruert slik at en vesentlig virale gen, ORF1629, blir inaktivert ved innsetting av kloramfenikol-acetyl-transferase som resulterer i et knock-out bacmid (BAC10: KO 1629), slik at den er ute av stand til å danne infeksjons baculovirions 28. Cotransfection av Sf9-celler med linearisert BAC10: KO 1629 og FERMT3-inneholdende overføringsvektor reparerer den inaktive ORF1629, ved transponering, som resulterer i en levedyktig genom som også har inkorporert den FERMT3-genet under kontroll av polyhedrin-promoteren 28..
Vi beskriver en renseprotokoll for isolering av meget rent rekombinant mus kindlin-3 via et trelage skritt kromatografisk tilnærming. Metodene som brukes her kan lett brukes på andre Hans-merkede proteiner. Vi har anvendt en ionebytter-trinn for ytterligere å rense kindlin-3, men vi tror at dette er en ytterligere pseudo affinitet trinn som kindlin-3 besitter en rekke grunnleggende rester, inkludert et poly-lysin strekning innenfor sin F1 domene. I tillegg er kindlin-3 anses å binde seg til og kommuniserer med det cytoplasmiske flate av plasma membran, hvor den fungerer, og derfor forutsi vi at gruppering av basis rester vil tillate proteinet å motvirke den negativt ladet membran.
Bufferne er beskrevet i renseprotokoller betraktes som standard, og blir ofte brukt i konstruksjons biologi. Den thermofluor analysen (Figur 5) viser at kindlin-3 er stabile i de fleste bufferbetingelser over pH 6,0. Dette var spesielt nyttig og viktig for å informere våre eksperimenter når studere kinldin-3: β1En tail interaksjon ved NMR som ga utmerket spektra ved pH 6,1 med lave konsentrasjoner av NaCl 12..
Før noen biofysiske undersøkelse kan utføres, er det viktig å demonstrere at det rensede proteinet av interesse er faktisk fullstendig brettet og er funksjonelt aktive. I en tidligere publikasjon demonstrerte vi at det rekombinante kindlin-3 uttrykt og renset ved hjelp av denne metode ble en monomer og monodispersed i løsning, vurdert ved størrelsesutelukkelses-kromatografi, dynamisk lysspredning, analytisk ultrasentrifugering og liten vinkel røntgen-spredning, og var også i stand til å binde og erkjenner membranen-distal NPxY og oppstrøms Serine / Threonine klynge av β 1A cytoplasmatiske haler 14, noe som bekrefter at det oppfører seg som de innfødte protein, noe som er i tråd med tidligere cellulære og fysiologiske studier 14,20,22. Anvendelse av en termisk stabilitet analysen er en ytterligere måte å foreslå the korrekt folding av et protein av interesse, som feilaktig foldet protein vil resultere i en høy fluorescens bakgrunnen på grunn av eksponerte hydrofobe rester.
Den kindlin familie av proteiner har vært fokus for mye oppmerksomhet siden deres uventet rolle som viktige coactivators av inte in vivo ble oppdaget. Dette har utløst mye krefter på å uttrykke dem rekombinant og løse sine strukturer. Hittil begrenset suksess er blitt rapportert å uttrykke milligram mengder av full lengde rekombinant protein, men vi har her beskrevne bruk av en baculovirus-system som tillater ekspresjon i stor skala på nivåer hvor strukturelle studier blitt mulig. Ved å generere store mengder av rekombinant kindlin-3 forventer vi at dette vil bidra til videre studier av dette protein. The baculovirus-drevet fremgangsmåte og rensing arbeidsflyten beskrevet her for rekombinant murint kindlin-3 kan også bli brukt til å uttrykke og rense den andre kindlin isoformer, Som også er vanskelig å uttrykke, og også ha poly-lysin strekker seg, og kan videre tilpasses for andre cytoplasmiske proteiner, slik som nukleinsyre-bindende proteiner, som ikke klarer å uttrykke i bakteriestammer.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Weixan Lu for teknisk assistanse i kulturen og vedlikehold av Sf9 celle bestandene. LAY ble støttet av en Medical Research Council (MRC) graduate studieplass. RJCG var en Royal Society University Research Fellow. The Oxford Divisjon for strukturbiologi er en del av Wellcome Trust Centre for Human Genetics, Wellcome Trust Kjerne Award Grant Antall 090532/Z/09/Z.
Sf-900 II serum free media (SFM) 1X liquid | Life Technoligies | 10902-096 | store at 4°C and warm to room temperature before use |
Cellfectin II Reagent | InVitrogen | 10362-100 | Alternatively, GeneJuice transfection (EMD) reagent can be used |
Streptomycin Sulphate (solid) | Melford | S0148 | Sterilise filter (0.22μm filter) before use |
Penicillin G, potassium salt (solid) | Melford | P0580 | Sterilise filter (0.22μm filter) before use |
CELLSTAR Sterile 6-well Culture Plate | Greiner bio-one | 657160 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10100-147 | |
Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8849 | Caution: Protease inhibitors are dissolved in DMSO |
Bovine pancrease deoxyribonuclease (Dnase) I | Sigma | D5025 | |
HisTrap FF (5ml) | GE Heathcare | 17-5286-01 | Requires an Äkta FPLC machine |
HiTrap Heparin (5ml) | GE Heathcare | 17-0407-01 | Requires an Äkta FPLC machine |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units (with Ultracel-50 membrane) | Millipore | UFC905024 | 15ml capacity and a MWCO of 50kDa protein concentrator |