유전자 독성 스트레스 후 신경 줄기 및 마우스 두뇌 개발의 전구 세포의 사정 세포주기의 진행 상황
Summary
티미 딘의 두 개의 아날로그의 행정, 에듀와 BrdU의는 임신 한 생쥐의 배아 마우스의 뇌에있는 신경 및 전구 세포의 세포주기 진행의 분석을 할 수 있습니다. 이 방법은 두뇌 개발 중에 전리 방사선 등의 유전 독성 스트레스의 효과를 확인하는 데 유용합니다.
Abstract
대뇌 피질의 신경 세포는 배아 뇌의 좌우 심실을 안감 pseudostratified 상피 세포를 형성하는 신경 줄기 및 전구 세포의 다른 유형 (NSPC)에서 뇌를 개발하는 동안 생성됩니다. 같은 이온화 방사선으로 유전 독성 스트레스는 NSPC의 높은 감도와 관련된 뇌의 발달에 매우 해로운 영향이있다. 관련된 세포 및 분자 메커니즘의 해명은 손상된 조직에서 세포주기를 통해 NSPC 진행 상황을 확인하는 정확한 방법을 필요로 세포의 이러한 특정 유형의 DNA 손상 반응의 특성에 의존한다. 여기에 임신 한 쥐와 태아 뇌의 관상 섹션이 두 티미 딘 유사체의 추가 검출 에듀와 BrdU의 연속 복강 내 주사에 근거하는 방법을 보여줍니다. 에듀와 BrdU의 양쪽 S 단계에서 복제 세포의 DNA에 통합되어 두 개의 서로 다른 기술 (아 지드 또는에 의해 감지자신의 동시 검출을 용이하게 특정 항체, 각각). 에듀와 BrdU의 염색은 다음 지느러미 telencephalon의 표준 영역에서 심실 마진으로부터의 거리의 함수의 각 NSPC 핵에 대해 결정된다. 따라서이 이중 라벨 기술은 DNA 손상에 반응하여 세포주기 정지로 이어지는 세포주기 체크 포인트를 활성화 한 것과에서 세포주기의 진행을 통해 세포를 구별 할 수 있습니다.
실험의 예는 듀가 직후 조사 및 BrdU의 전에 주입 및 사출 다음 4 시간 이내에 실시하는 분석에서 제시된다. 이 프로토콜들이 조사되었다하는 세포주기의 위상의 함수 NSPC의 급성 DNA 손상 반응의 정확한 분석을 제공한다. 이 방법은 생체 조직의 세포주기 진행에 대한 특정 치료의 효과를 결정하기 위해 쉽게 transposable 많은 다른 시스템이다.
Introduction
배아 두뇌 개발하는 동안 대뇌 피질의 투사 신경 세포는 신경 줄기 및 전구 세포 (NSPC)의 다른 유형으로 구성 pseudostratified 상피는 라인 측면 심실, 심실 영역에 생성됩니다. NSPC 중, 신경 줄기 세포의 역할을 방사 아교 세포 (RGC)가,, (INM) interkinetic 핵 마이그레이션을 받아야 : 그들은 심실 영역의 기저 한계에서 뇌실과 S 상의 표면에 유사 분열을 수행 (VZ) 1,2,3. 그들은 나눌 수 있습니다 대칭으로 두 RGC를 생성하거나 불균형 한 RGC 하나의 신경 세포 또는 중간 전구 세포 (IPC) 4, 5를 생성합니다. IPC는 마지막으로 대칭 분할 후 그들은 두 개의 미성숙 투사 뉴런 6-8을 생성 subventricular 영역라는 상부의 확산 층 (SVZ)로 이동한다. RGC는 달리, IPC (9 검토) INM를 받아야하지 않습니다. 새로 생성 된 신경 세포는 백분율대뇌 피질의 플레이트 (CP) 10, 8 최종 목적지에 도달하기 위해 중간 영역 (IZ)를 통해 방사 섬유를 따라 방사형으로 먹었다. 모든 이벤트의 완벽한 타이밍은 정확한 대뇌 피질의 발달에 필수적이다. 예를 들어 신경 전구 인구의 분화 증식에서 스위치는 G1 단계 지속 기간 (11), (12)에 의해 제어된다. G1 단계의 연장은 세포 분화에 따라서 상관 관계.
등 (13에서 검토) 이온화 방사선, 심각하게 손상 뇌의 발달로 유전자 독성 스트레스. 우리와 다른 NSPC 방사선에 의한 세포 사멸 14, 15, 16에 대한 높은 경향이있는 것으로 나타났습니다. 전리 방사선은 세포 증식에 가장 심각하게 손상되어 DNA 이중 가닥의 휴식을 유도한다. 자전거 세포의 DNA 손상 반응 (DDR)의 하나의 필수 구성 요소는 G1 / S 또는 G2 / M 전환이나 S시 세포주기 체크 포인트의 활성화입니다상 (내 S 체크 포인트) 17-21. 이들은 DNA 손상 보수 또는 너무 손상 세포의 제거를위한 시간을 제공하는 세포주기 진행을 차단. 따라서, 세포 사멸뿐만 아니라 지연 세포주기 진행은 방사선 노출 22-24 이온화에 응답 뇌 발달을 변경할 수있다. 이것은 조사 된 마우스 태아 뇌 NSPC에서 세포주기 체크 포인트의 활성화를 평가하는 방법을 개발하는 것이 흥미 있었다.
세포주기의 진행을 일상적 티미 딘 유사체, 5 – 브로 모-2'-데 옥시 우리 딘 (BrdU의)의 혼입을 사용하여 이어진다. BrdU의은 DNA가 복제되어 세포주기의 S 단계에서 통합된다. BrdU의에 대한 항체의 사용은 BrdU의 펄스 동안의 S 단계에서 세포의되었습니다 이후 검출을 허용한다.
신규 티미 딘 유사체, 5 -에 티닐-2'-데 옥시 우리 딘 (EDU)는 형광 지드에 의해 검출된다. 듀와 B를 검출하는 다른 방법 RDU는 세포주기 진행의 연구에 유용 모두 티미 딘 아날로그의 동시 검출을 가능하게 25을 교차 반응하지 않는다. 보통 세포는 처음 EDU와 펄스와 다음 모두 포함 과정 사이의 시간이 시간 (25, 26)의 커플을 지속 BrdU의와 펄스된다. 에듀을 포함하는 배지에서 BrdU의 첨가 EDU의 배제와 DNA에 BrdU의의를 우선적으로 편입 결과, 동안 만 BrdU의 내장 27 미디어 결과에 몰 또는 반 몰의 BrdU와 EDU (25)의 동시뿐만 아니라. 이것은 일반적으로 이전의 두 번째 레이블의 첨가 배양 배지에서 첫 번째 레이블을 제거하는 데 필요한 세척 단계를 제거하여 이중 라벨 프로토콜을 단순화합니다. 이것은 또한 S 상 항목 또는 세포 인구의 출구의 정확한 타이밍을 결정하는 세척 단계는 할 수 없습니다 생체 내 연구에 대한 특별한 관심입니다.
t "> 최근, 에듀와 BrdU의 23, 24 및 22을 사용하여 배아 마우스 뇌의 듀얼 펄스 표시하는 방법은 자궁 조사에 후 세포주기의 진행과 NSPC의 INM을 분석하기 위해 개발되었습니다. 또한이 입증되었습니다 동안, 그 S 단계는, 마우스 세포는 먼저 euchromatin 영역 다음 근심 이질 염색질 28,29,30를 복제합니다. 흥미롭게도, interphasic 핵으로 클러스터 된 다른 염색체의 근심 이질 염색질도 chromocenters로 알려진 밝은 초점으로 DAPI 염색에 의해 쉽게 감지 염색질 초점을 형성한다. 따라서, euchromatin과 chromocenters의 차이 에듀와 BrdU의 염색에보다 정확하게 NSPC의 S 단계의 진행을 분석하는 것을 도왔다.이 메서드는이 체크 포인트는 게놈의 안정성을 위해 중요한 것으로되어 있기 때문에 매우 놀라운 일이다 NSCP 22-24에서 G1 / S 체크 포인트의 명백한 부족의 데모를 허용했다. 여러 특급듀 및 BrdU의 펄스의 다양한 조합에 기초 erimental 디자인은 복부와 등쪽 telencephalon에서 세포주기의 진행을 분석하기 위해 사용되어왔다. 여기, 우리는 E14.5 마우스 배아의 자궁 조사에서 다음과 같은 제 4 시간 내 NSPC의 급성 DNA 손상의 연구를 허용하는 프로토콜의 예를 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
에듀 1.5 시간의 정관에 따라 여기에 설명 된 실험 설계하기 전에 조사가 허용 된 후 즉시 조사 및 BrdU의 정관 NSPCs이 후 S 및 G2 / M의 체크 포인트를 활성화 할 수 있지만, 1 차 시간 동안 G1 / S 체크 포인트 수 없습니다 시위 태아 쥐의 뇌에서 유전자 독성 스트레스. 우리는 우리가 구체적으로 S 상 항목의 비율을 감상 할 수 있도록, 에듀 단지 1 시간 마우스를 희생하기 전에, 조사 및 BrdU의 후 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
상테 – 환경 회사 – 이러한 결과로 이어지는 연구는 프랑스 전력 (EDF)에서 그리고 난 직원은 국립 드 라 공들인보기에서, 323,267을 부여 계약에 따라 유럽 연합의 제 7 차 프레임 워크 프로그램 (FP7/2007-2013)로부터 자금을받은 N °있다 등 상테 – 진통 (ANR-SEST, Neurorad).
Materials
| EdU | Life Technologies | A10044 | 1 mg/ml |
| BrdU | Life Technologies | B5002 | 5 mg/ml |
| IBL 637 | CIS BIO International | ||
| Tissu Tek VIP | Leica | ||
| Microtome | Leica | RM 2125 RT | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Click-iT EdU Alexa 488 imaging kit | Life Technologies | C10083 | |
| Anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1/300 |
| Goat anti mouse-Alex594 | Life Technologies | A11001 | 1/400 |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Polysine slide | Thermo scientific | J2800AMNZ | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-068 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Microscope BX51 | Olympus | ||
| Confocal microscope SPE | Leica | ||
| Prism software | Graphpad | Version 5.0c | |
| Photoshop software | Adobe |
Riferimenti
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