Avaliando a progressão do ciclo celular de tronco neurais e as células progenitoras no desenvolvimento do cérebro do rato após estresse genotóxico
Summary
A administração de dois análogos de timidina, EdU e BrdU, em ratinhas grávidas permite a análise da progressão do ciclo celular em células progenitoras neurais e no cérebro do rato embrionário. Este método é útil para determinar os efeitos do stress genotóxico, incluindo a radiação ionizante, durante o desenvolvimento do cérebro.
Abstract
Os neurónios do córtex cerebral são gerados durante o desenvolvimento do cérebro a partir de diferentes tipos de células estaminais e progenitoras neurais (NSPC), que formam um epitélio pseudo alinhando os ventrículos laterais do cérebro embrionário. Estresses genotóxicos, como a radiação ionizante, têm efeitos altamente deletérios sobre o cérebro em desenvolvimento relacionado com a alta sensibilidade do NSPC. A elucidação dos mecanismos celulares e moleculares envolvidas depende da caracterização da resposta a danos no ADN destes tipos particulares de células, o que requer um método preciso para determinar a progressão NSPC longo do ciclo celular no tecido danificado. Aqui é mostrado um método baseado em sucessivas injeções intraperitoneais Edu e BrdU em camundongos grávidas e ainda a detecção destes dois análogos da timidina em cortes coronais do cérebro embrionário. EdU BrdU e ambos são incorporados no ADN das células em replicação durante a fase S e são detectados através de duas técnicas diferentes (ou azidaum anticorpo específico, respectivamente), que facilitam a sua detecção simultânea. EdU e coloração BrdU são então determinados para cada núcleo NSPC em função da sua distância a partir da margem do ventrículo numa região padrão do telencéfalo dorsal. Assim, esta técnica de marcação dupla permite distinguir células que progrediu ao longo do ciclo celular das que ter activado um checkpoint do ciclo celular, levando à paragem do ciclo celular em resposta ao dano do DNA.
Um exemplo de experimento é apresentado, no qual EdU foi injetado antes da irradiação e BrdU imediatamente após e análises realizadas no âmbito da 4 h após a irradiação. Este protocolo apresenta uma análise precisa da resposta de dano de DNA aguda de NSPC em função da fase do ciclo celular em que eles foram irradiadas. Este método é facilmente transponível para muitos outros sistemas, a fim de determinar os efeitos de um tratamento específico sobre a progressão do ciclo celular em tecidos vivos.
Introduction
Durante o desenvolvimento do cérebro embrionário, de neurónios de projecção do córtex cerebral são gerados na zona ventricular, um epitélio pseudo composto de diferentes tipos de estaminais neuronais e células progenitoras (NSPC) que reveste os ventrículos laterais. Entre NSPC, as células gliais radiais (RGC), que servem como células estaminais neurais, sofrer migração nuclear interkinetic (INM): eles realizam a mitose na superfície do ventrículo e da fase S no limite basal da zona ventricular (VZ) 1, 2,3. Eles podem dividir ou simetricamente para gerar dois RGC ou assimetricamente para gerar um RGC e um neurônio ou uma célula intermediária progenitor (IPC) 4, 5. IPC migrar para uma camada sobrejacente proliferando chamada zona subventricular (SVZ), onde depois de uma última divisão simétrica geram dois neurônios de projeção imaturos 6-8. Ao contrário do RGC, o IPC não sofrem INM (revisado em 9). Neurônios recém-gerados Migrcomeu radialmente ao longo das fibras radiais através da zona intermediária (IZ) para chegar ao seu destino final na placa cortical (CP) 10, 8. O timing perfeito de todos estes eventos é essencial para um desenvolvimento cortical correta. Por exemplo, o interruptor de proliferação a diferenciação de populações progenitoras neurais é controlada pela duração da fase G1 11, 12. O prolongamento da fase G1 assim correlaciona com a diferenciação celular.
Estresse genotóxico, como radiação ionizante, o desenvolvimento do cérebro severamente prejudicar (revisado em 13). Nós e outros autores mostraram que NSPC são altamente propensos a apoptose induzida por radiação 14, 15,16. As radiações ionizantes induzir rupturas dos filamentos de DNA duplo que são os danos mais graves para células em proliferação. Um componente essencial da resposta a danos do DNA (DDR) em células de ciclismo é a ativação de pontos de controle do ciclo celular nas transições G1 / S ou G2 / M ou durante Sfase (intra-S checkpoint) 17-21. Eles bloqueiam a progressão do ciclo celular para dar tempo para a reparação de danos ao DNA ou eliminação de células muito danificadas. Consequentemente, a morte celular, bem como a progressão do ciclo celular retardada pode alterar o desenvolvimento do cérebro em resposta à exposição a radiação ionizante 22-24. Era, portanto, interessante para desenvolver um método para avaliar a activação de checkpoints do ciclo celular em NSPC no cérebro do rato embrionário irradiado.
A progressão do ciclo celular é normalmente seguido usando a incorporação de um análogo da timidina, 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU). BrdU é incorporado durante a fase S do ciclo celular, quando o ADN está a replicar. A utilização de um anticorpo contra BrdU permite posteriormente a detecção de células que estavam na fase S durante o pulso de BrdU.
Um análogo da timidina romance, 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) é detectada por um azida fluorescente. As diferentes maneiras de detectar EdU e B RDU não reagem de forma cruzada 25, permitindo a detecção simultânea de ambos os análogos de timidina, a qual é útil para o estudo da progressão do ciclo celular. Normalmente, as células são pulsadas com EdU primeiro e, em seguida, pulsadas com BrdU, em que o tempo entre as duas incorporações dura duas horas 25, 26. A adição de BrdU em meios de cultura contendo EdU resulta preferencialmente incorporação de BrdU no ADN com a exclusão de EdU, enquanto que a adição simultânea de EdU 25 com BrdU equimolar ou equimolar metade para os meios de comunicação provoca apenas a incorporação de BrdU 27. Isto simplifica o protocolo de marcação dupla, eliminando as etapas de lavagem que são normalmente necessários para a remoção da etiqueta a partir do primeiro meio de cultura antes da adição da segunda etiqueta. Este também é de um interesse especial para o estudo in vivo, em que os passos de lavagem não são possíveis, para determinar o momento preciso da entrada na fase S ou saída da população de células.
t "> Recentemente, um método de rotulagem de duplo pulso em cérebro embrionário do rato usando EdU e BrdU 23, 24,22 foi desenvolvido para analisar a progressão do ciclo celular e INM de NSPC no útero após a irradiação. Além disso, tem sido demonstrado que, durante fase S, células de camundongo replicar primeiro as regiões eucromatina e, em seguida, a heterocromatina pericêntrica 28,29,30. Curiosamente, heterochromatin pericêntrica de diferentes cromossomos agrupados em núcleos interphasic para formar focos heterocromática também conhecido como chromocenters e facilmente detectável pela coloração DAPI como focos brilhante. Portanto, os diferenciais Edu e BrdU colorações de eucromatina e chromocenters nos ajudou a analisar com mais precisão a progressão da fase S de NSPC.Este método permitiu a demonstração da aparente falta de G1 / S checkpoint em NSCP 22-24, o que é bastante surpreendente, pois o ponto de verificação é suposto ser crítico para a estabilidade do genoma. Vários experimental desenhos com base em várias combinações de edu e BrdU pulsos foram utilizados para analisar a progressão do ciclo celular, no telencéfalo ventral e dorsal. Aqui, damos um exemplo de protocolos para permitir o estudo do dano ao DNA aguda da NSPC no primeiro 4 horas após a irradiação em utero de embriões E14.5 do mouse.
Protocol
Representative Results
Discussion
O delineamento experimental descrito aqui com base na incorporação de EdU 1,5 hr antes da irradiação e incorporação de BrdU imediatamente após a irradiação permitiu a demonstração de que NSPCs são capazes de ativar S e G2 / M, mas não a ponto de verificação G1 / S durante a 1 ª hora após a estresse genotóxico no cérebro fetal mouse. Realizamos outros experimentos em que EdU foi injetado em diferentes momentos após a irradiação e BrdU, apenas 1 hora antes de ratos sacrifícios, permitindo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A investigação conducente a estes resultados foi financiada pelo Sétimo Programa-Quadro da União Europeia (FP7/2007-2013), sob contrato de subvenção n ° 323267, da Electricité de France (EDF) e de l'Agence Nationale de la Recherche – Santé-Environnement et Santé-Travail (ANR-SEST, Neurorad).
Materials
| EdU | Life Technologies | A10044 | 1 mg/ml |
| BrdU | Life Technologies | B5002 | 5 mg/ml |
| IBL 637 | CIS BIO International | ||
| Tissu Tek VIP | Leica | ||
| Microtome | Leica | RM 2125 RT | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Click-iT EdU Alexa 488 imaging kit | Life Technologies | C10083 | |
| Anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1/300 |
| Goat anti mouse-Alex594 | Life Technologies | A11001 | 1/400 |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Polysine slide | Thermo scientific | J2800AMNZ | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-068 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Microscope BX51 | Olympus | ||
| Confocal microscope SPE | Leica | ||
| Prism software | Graphpad | Version 5.0c | |
| Photoshop software | Adobe |
Riferimenti
- Rakic, P. Specification of cerebral cortical areas. Science. 241, 170-176 (1988).
- Sauer, F. Mitosis in he neural tube. J Comp Neurol. , 377-399 (1935).
- Taverna, E., Huttner, W. B. Neural progenitor nuclei IN motion. Neuron. 67, 906-914 (2010).
- Committee, B. Embryonic vertebrate central nervous system: revised terminology. Anat Rec. 166, 257-261 (1970).
- Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited. Nature Reviews. Neuroscience. 9, 110-122 (2008).
- Miyata, T., et al. Asymmetric production of surface-dividing and non-surface-dividing cortical progenitor cells. Development. 131, 3133-3145 (2004).
- Haubensak, W., Attardo, A., Denk, W., Huttner, W. B. Neurons arise in the basal neuroepithelium of the early mammalian telencephalon: a major site of neurogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 3196-3201 (2004).
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7, 136-144 (2004).
- Merot, Y., Retaux, S., Heng, J. I. Molecular mechanisms of projection neuron production and maturation in the developing cerebral cortex. Seminars in Cell & Developmental Biology. 20, 726-734 (2009).
- Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex. Trends Neurosci. 27, 392-399 (2004).
- Salomoni, P., Calegari, F. Cell cycle control of mammalian neural stem cells: putting a speed limit on G1. Trends Cell Biol. 20, 233-243 (2010).
- Calegari, F., Haubensak, W., Haffner, C., Huttner, W. B. Selective lengthening of the cell cycle in the neurogenic subpopulation of neural progenitor cells during mouse brain development. J Neurosci. 25, 6533-6538 (2005).
- Andres-Mach, M., Rola, R., Fike, J. R. Radiation effects on neural precursor cells in the dentate gyrus. Cell Tissue Res. 331, 251-262 (2008).
- Semont, A., et al. Involvement of p53 and Fas/CD95 in murine neural progenitor cell response to ionizing irradiation. Oncogene. 23, 8497-8508 (2004).
- Nowak, E., et al. Radiation-induced H2AX phosphorylation and neural precursor apoptosis in the developing brain of mice. Radiat Res. 165, 155-164 (2006).
- Gatz, S. A., et al. Requirement for DNA ligase IV during embryonic neuronal development. J Neurosci. 31, 10088-10100 (2011).
- Denekamp, J. Cell kinetics and radiation biology. International Journal of Radiation Biology and Related Studies in Physics, Chemistry, and Medicine. 49, 357-380 (1986).
- Hartwell, L. H., Weinert, T. A. Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events. Science. 246, 629-634 (1989).
- Weinert, T. A., Hartwell, L. H. Characterization of RAD9 of Saccharomyces cerevisiae and evidence that its function acts posttranslationally in cell cycle arrest after DNA damage. Mol Cell Biol. 10, 6554-6564 (1990).
- Tolmach, L. J., Jones, R. W., Busse, P. M. The action of caffeine on X-irradiated HeLa cells. I. Delayed inhibition of DNA synthesis. Radiat Res. 71, 653-665 (1977).
- Painter, R. B., Young, B. R. Radiosensitivity in ataxia-telangiectasia: a new explanation. Proc Natl Acad Sci U S A. 77, 7315-7317 (1980).
- Etienne, O., Roque, T., Haton, C., Boussin, F. D. Variation of radiation-sensitivity of neural stem and progenitor cell populations within the developing mouse brain. Int J Radiat Biol. 88, 694-702 (2012).
- Roque, T., et al. Lack of a p21waf1/cip -dependent G1/S checkpoint in neural stem and progenitor cells after DNA damage in vivo. Stem Cells. 30, 537-547 (2012).
- Rousseau, L., et al. In vivo importance of homologous recombination DNA repair for mouse neural stem and progenitor cells. PLoS One. 7, 12 (2012).
- Bradford, J. A., Clarke, S. T. Dual-pulse labeling using 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) and 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) in flow cytometry. Curr Protoc Cytom. , (2011).
- Deckbar, D., et al. The limitations of the G1-S checkpoint. Cancer Res. 70, 4412-4421 (2010).
- Manual, Click-iT EdU Imaging Kit. , (2011).
- Weidtkamp-Peters, S., Rahn, H. P., Cardoso, M. C., Hemmerich, P. Replication of centromeric heterochromatin in mouse fibroblasts takes place in early, middle, and late S phase. Histochem Cell Biol. 125, 91-102 (2006).
- Wu, R., Terry, A. V., Singh, P. B., Gilbert, D. M. Differential subnuclear localization and replication timing of histone H3 lysine 9 methylation states. Mol Biol Cell. 16, 2872-2881 (2005).
- Wu, R., Singh, P. B., Gilbert, D. M. Uncoupling global and fine-tuning replication timing determinants for mouse pericentric heterochromatin. J Cell Biol. 174, 185-194 (2006).
- Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness Jr, V. S. The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15, 6046-6057 (1995).
- Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. J Vis Exp. , (2010).
