Vurdere Cell Cycle Progresjon av Neural Stem og stamceller i mus utvikling av hjernen etter Gentoksisk Stress

Summary

Administrasjon av to analoger av tymidin, Edu og BrdU, i drektige mus gjør analyse av cellesyklus progresjon i nevrale og stamceller i den embryonale mus hjernen. Denne fremgangsmåten er nyttig for å bestemme effektene av genotoksiske stress, inkludert ioniserende stråling, ved utvikling av hjernen.

Abstract

Nevroner i hjernebarken er generert under hjernens utvikling fra ulike typer nevrale stamceller og stamceller (NSPC), som danner et pseudostratified epitel fôr sideventriklene av embryonale hjernen. Genotoksiske påkjenninger, slik som ioniserende stråling, har meget skadelig effekt på utviklingen av hjernen er relatert til den høye følsomheten til NSPC. Belysning av de cellulære og molekylære mekanismer som er involvert avhenger av karakteriseringen av DNA-skade responsen av disse spesielle typer av celler, noe som krever en nøyaktig metode for å bestemme NSPC progresjon gjennom cellesyklusen på det skadede vev. Her er det vist en metode basert på suksessive intraperitoneale injeksjoner av Edu og BrdU hos gravide mus og ytterligere påvisning av de to tymidinanaloger i koronale seksjoner av embryonale hjernen. Edu og BrdU begge er innlemmet i DNA av reproduserende celler under S-fasen og blir oppdaget av to forskjellige teknikker (Azide elleret spesifikt antistoff, henholdsvis), som letter deres samtidige påvisning. Edu og BrdU flekker er så bestemt for hver NSPC kjernen i funksjon av sin avstand fra ventrikkel margin i en standard regionen i rygg telencephalon. Således denne dobbeltmerking teknikken tillater å skille celler som utviklet seg gjennom cellesyklusen fra de som har aktivert en cellesyklus kontrollpunkt som fører til cellesyklusarrest i respons til DNA-skade.

Et eksempel på forsøk er presentert, i hvilket Edu ble injisert før bestråling og BrdU umiddelbart etter og analyser utført innen 4 timer etter bestråling. Denne protokollen gir en nøyaktig analyse av den akutte respons på DNA-skade NSPC som funksjon av fasen av cellesyklus ved hvilken de er blitt bestrålt. Denne metoden er lett transposable til mange andre systemer for å bestemme virkningen av en bestemt behandling på cellesyklusprogresjon i levende vev.

Introduction

Under embryonal utvikling av hjernen, er projeksjon nevroner i hjernebarken generert i ventrikkel sone, en pseudostratified epitel sammensatt av ulike typer nevrale stilk og stamceller (NSPC) som linjer sideventriklene. Blant NSPC de radiale gliaceller (RGC), som fungerer som neurale stamceller, gjennomgår interkinetic atom migrasjon (INM): de utfører mitose ved overflaten av ventrikkel-og S-fasen ved den basale grensen for den ventrikulære sone (VZ) ^{1, 2,3.} De kan dele enten symmetrisk å generere to RGC eller asymmetrisk å generere ett RGC og en nervecelle eller et mellom stamceller (IPC) ^{4, 5.} IPC migrere til en overliggende voksende lag som kalles subventricular sone (SVZ), der etter en siste symmetrisk divisjon genererer de to umodne projeksjon nevroner ^6-8. I motsetning til RGC, trenger IPC ikke gjennomgå INM (anmeldt i ^9). Nylig genererte nevroner MIGRspiste radialt langs radiale fibrene gjennom mellomliggende sone (IZ) for å nå sin endelige destinasjon i cortical plate (CP) ^{10, 8.} Den perfekte timing av alle disse hendelsene er avgjørende for en korrekt hjernebarken. For eksempel overgangen fra proliferasjon til differensiering av nevrale stamceller populasjoner styres av G1 fase varigheten ^{11, 12.} Forlengelsen av G1 fasen korrelerer altså med celledifferensiering.

Gentoksisk stress, for eksempel ioniserende stråling, alvorlig svekker hjernens utvikling (anmeldt i ^13). Vi og andre har vist at NSPC er svært utsatt for stråling-indusert apoptose ^{14, 15,16.} Ioniserende stråling induserer DNA dobbel tråd pauser som er den mest alvorlige skader på prolifererende celler. En viktig del av DNA Damage Response (DDR) i sykkel celler er aktiveringen av cellesyklus sjekkpunkter på G1 / S eller G2 / M overganger eller under Sfase (intra-S sjekkpunkt) ^17-21. De blokkere cellesyklusprogresjon for å gi tid for DNA-skade reparasjon eller eliminering av for skadede celler. Følgelig kan celledød, så vel som forsinket cellesyklusprogresjon forandre hjernens utvikling som respons på ioniserende stråling ^22-24. Det var derfor interessant å utvikle en metode for å vurdere aktivering av cellesykluskontrollpunkter i NSPC i det bestrålte mus embryonale hjernen.

Progresjonen av cellesyklusen blir rutinemessig fulgt ved hjelp av inkorporering av en analog av tymidin, 5-brom-2'-deoksyuridin (BrdU). BrdU er innlemmet i S-fasen av cellesyklusen, når DNA replikere. Anvendelse av et antistoff mot BrdU lar deretter påvisning av cellene som var i S-fasen i løpet av pulsen av BrdU.

A novel tymidin analog, 5-Ethynyl-2'-deoxyuridin (EDU) blir detektert av en fluoriserende azid. De ulike måter å oppdage Edu og B Rdu ikke kryssreagerer ^25, slik at den samtidige deteksjon av begge tymidin-analoger, som er nyttig for studier av cellesyklus-progresjon. Vanligvis celler er første pulserende med Edu og deretter pulserende med BrdU, der tiden mellom begge incorporations varer par timer ^{25, 26.} Tilsetting av BrdU i kulturmedier som inneholder Edu resulterer i fortrinnsvis innlemmelse av BrdU i DNA med utelukkelse av Edu, mens samtidig tillegg av Edu ²⁵ med ekvimolar eller halv ekvimolart BrdU til media resultater i bare BrdU innlemmelse ^27. Dette forenkler den doble etiketten protokollen ved å eliminere de vasketrinn som normalt kreves for å fjerne den første etiketten fra kulturmediene før tilsetning av den andre etiketten. Dette er også av spesiell interesse for in vivo-undersøkelse, hvor vasketrinnene er det ikke mulig å bestemme den nøyaktige timing av S-fasen inngang eller utgang av cellepopulasjonen.

t "> Nylig ble en fremgangsmåte for dobbeltpulsmerking i embryonale musehjerne ved hjelp Edu og BrdU ^{23, 24,22} har blitt utviklet for å analysere cellesyklusprogresjon og INM av NSPC etter in utero bestråling. Videre har det blitt demonstrert at, i løpet S-fasen, museceller replikere første de eukromatin regioner og deretter pericentric heterochromatin ^28,29,30. Interessant å pericentric heterochromatin forskjellige kromosomer gruppert i interphasic kjerner danne heterochromatic foci også kjent som chromocenters og lett synlig ved DAPI flekker som lyse foci. Derfor differensial Edu og BrdU stainings av eukromatin og chromocenters hjulpet oss til å analysere mer presist S fase progresjon av NSPC.

Denne metoden tillot demonstrasjonen av den tilsynelatende mangelen på G1 / S sjekkpunkt i NSCP ^22-24, noe som er ganske overraskende siden dette punktet er ment å være kritisk for genomstabilitet. Flere experimental design basert på ulike kombinasjoner av Edu og BrdU pulser har blitt brukt til å analysere cellesyklus progresjon i ventral og dorsal telencephalon. Her gis et eksempel på protokoller som tillater undersøkelse av den akutte DNA-skade av NSPC innen de første 4 timer etter in utero bestråling av E14.5 museembryoer.

Protocol

En. Animal Prosedyrer Denne protokollen er utformet i samsvar med det europeiske fellesskaps rådsdirektiv av 24 november 1986 (86/609/EØF) og er godkjent av vår institusjonelle komité for dyrevelferd (CETEA-CEA DSV IdF). Injeksjoner med Edu / BrdU og bestråling av E14.5 gravide mus (Figur 2A). Forbered en løsning av Edu på 1 mg / ml og BrdU på 5 mg / ml i PBS. Utfør en intra-peritoneal injeksjon (IP) for 100 mL av EDU-løsning ved hjelp av en 25 …

Representative Results

I eksperimentet beskrevet i figur 2, ble administrert EDU 1,5 time før bestråling og BrdU like etter bestråling. Fire typer av celler ble deretter skilles i de kortikale skiver fremstilt ved en eller fire timer etter bestråling, etter innarbeidelse av enten Edu eller BrdU, begge eller ingen (figurene 2A og 2B). Viktigere, hverken Edu nor BrdU inkorporering endret nivå av strålingsinduserte apoptose (data ikke vist). Videre er de farvemetoder tillater kun påvisnin…

Discussion

Eksperimentell design beskrevet her basert på inkorporering av Edu 1,5 time før bestråling og inkorporering av BrdU umiddelbart etter bestråling tillot demonstrasjonen som NSPCs er i stand til å aktivere S og G2 / M sjekkpunkter, men ikke G1 / S sjekkpunkt i løpet av en ^st hr etter en gentoksisk stress i fosterets mus hjernen. Vi utførte andre eksperimenter der Edu har blitt injisert på forskjellige tidspunkter etter bestråling og BrdU, bare en time før muse offer, slik at vi kan spesielt sette pris…

Materials

EdU	Life Technologies	A10044	1 mg/ml
BrdU	Life Technologies	B5002	5 mg/ml
IBL 637	CIS BIO International
Tissu Tek VIP	Leica
Microtome	Leica	RM 2125 RT
Triton X-100	Sigma-Aldrich	93443
Click-iT EdU Alexa 488 imaging kit	Life Technologies	C10083
Anti-BrdU	GE Healthcare	RPN202	1/300
Goat anti mouse-Alex594	Life Technologies	A11001	1/400
Fluoromount	SouthernBiotech	0100-01
Polysine slide	Thermo scientific	J2800AMNZ
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
PBS	Life Technologies	20012-068
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Microscope BX51	Olympus
Confocal microscope SPE	Leica
Prism software	Graphpad		Version 5.0c
Photoshop software	Adobe