अप्रत्यक्ष Immunofluorescent (IIF) assays पारंपरिक रूप से मानव सीरम में antinuclear एंटीबॉडी (एएनए) का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इन एंटीबॉडी की उपस्थिति प्रणालीगत autoimmune आमवाती रोगों (सार्ड) के निदान में सहायता कर सकते हैं. इस प्रोटोकॉल को प्रभावी ढंग से सही इन autoantibodies पता लगाने के लिए IIF तकनीक का प्रदर्शन करने के लिए कैसे करें.
एना परीक्षण पर संधिवातीयशास्त्र स्थिति बयान की अमेरिकी कॉलेज एना 1 स्क्रीनिंग के लिए स्वर्ण मानक पद्धति के रूप में IIF के उपयोग के अनुबंध. IIF विशेषज्ञ हाथ में एक उत्कृष्ट स्क्रीनिंग परीक्षा है, प्रसंस्करण और IIF पढ़ने के तकनीकी कठिनाइयों स्लाइड – जैसे श्रम गहन स्लाइड प्रसंस्करण, मैनुअल पढ़ने, अनुभवी लिए की जरूरत है, प्रशिक्षित प्रौद्योगिकीविदों और अंधेरे कमरे के उपयोग के रूप – IIF विधि बनाने आधुनिक, स्वचालित प्रयोगशालाओं के कार्यप्रवाह में फिट करने के लिए मुश्किल.
उच्च गुणवत्ता एना स्क्रीनिंग की दिशा में पहला और महत्वपूर्ण कदम सावधान स्लाइड प्रसंस्करण है. यह प्रक्रिया श्रम गहन है, और पूरी प्रक्रिया की समझ है, साथ ही विवरण और अनुभव करने के लिए ध्यान की आवश्यकता है.
स्लाइड पढ़ने अंधेरे कमरे में फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा किया जाता है, और सेल चक्र के संदर्भ में, विभिन्न पैटर्न के साथ परिचित हैं, जो प्रशिक्षित प्रौद्योगिकीविदों द्वारा किया जाता हैऔर अंतरावस्था और विभाजित कोशिकाओं की आकारिकी. IIF सही ढंग से इस तकनीक का प्रदर्शन करने के लिए कदम को समझने, सार्ड के लिए पहली पंक्ति प्रदर्शन उपकरण प्रदान की है कि महत्वपूर्ण है.
हाल ही में, डिजिटल इमेजिंग सिस्टम IIF स्लाइड्स की स्वचालित पढ़ने के लिए विकसित किया गया है. ऐसे नोवा देखें स्वचालित फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के रूप में इन पद्धतियों, दिनचर्या IIF कार्यप्रवाह को कारगर बनाने के लिए तैयार कर रहे हैं. नोवा देखें जिससे व्याख्या से छवि अधिग्रहण को अलग करने, कुओं की उच्च संकल्प डिजिटल छवियों का अधिग्रहण और दुकानों; छवियों उच्च संकल्प कंप्यूटर मॉनिटर पर व्याख्या की एक में देखा जाता है. यह भविष्य में संदर्भ के लिए छवियों को संग्रहीत करता है और छवियों पर फ्लोरोसेंट रोशनी की तीव्रता डेटा उपलब्ध कराने के द्वारा संचालक की व्याख्या का समर्थन करता है. यह भी प्रारंभिक सकारात्मक या नकारात्मक रूप में परिणाम categorizes, और सकारात्मक नमूने के लिए पैटर्न मान्यता प्रदान करता है. संक्षेप में, यह darkroom के लिए की आवश्यकता समाप्त, और automates और IIF readi सुव्यवस्थितएनजी / व्याख्या कार्यप्रवाह. सबसे महत्वपूर्ण बात यह पाठकों और रीडिंग के बीच स्थिरता बढ़ जाती है. इसके अलावा, बारकोड वाले स्लाइड्स के उपयोग के साथ, प्रतिलेखन त्रुटियों नमूना traceability और सकारात्मक रोगी की पहचान कराने के द्वारा समाप्त हो जाते हैं. इस वृद्धि रोगी डेटा अखंडता और सुरक्षा में परिणाम है.
इस वीडियो के समग्र लक्ष्य स्लाइड प्रसंस्करण, आम IIF पैटर्न की पहचान है, और इस तकनीक को आसान बनाने और अनुरूप नई प्रगति का परिचय सहित, IIF प्रक्रिया का प्रदर्शन है.
अवधि antinuclear प्रतिरक्षी (एएनए) डीएनए, प्रोटीन और ribonucleoproteins 1, 2 सहित सेल नाभिक के घटक के साथ प्रतिक्रिया है कि autoantibodies की एक किस्म का वर्णन करता है. एचईपी-2 सेल, एंटीजन के सैकड़ों के साथ एक देशी प्रोटीन सरणी, एना 1 का पता लगाने के लिए एक आदर्श सब्सट्रेट प्रदान करता है. मानव सीरम में एना का पता लगाने के संयोजी ऊतक रोगों के लिए एक महत्वपूर्ण स्क्रीनिंग उपकरण है, और IIF एना 1 के परीक्षण के लिए संदर्भ विधि है. हाल ही में, एचईपी-2 कोशिकाओं पर IIF प्रतिजन विशेष immunoassays और मल्टीप्लेक्स के तरीकों के साथ कुछ प्रयोगशालाओं में जगह दी गई है. कारण झूठी नकारात्मक परिणामों पर चिंता और चिकित्सकों के लिए पारदर्शिता की कमी के कारण, संधिवातीयशास्त्र के अमेरिकी कॉलेज एचईपी-2 कोशिकाओं का उपयोग IIF एना 1 स्क्रीनिंग के लिए "सोने के मानक 'होना चाहिए कि निष्कर्ष निकाला है कि एक टास्क फोर्स का गठन किया.
कारण एना स्क्रीनिंग के व्यक्तिपरक स्वभाव के कारण, एचईपी-2 कोशिकाओं की गुणवत्ता में हैपरिणाम की सटीक और आत्मविश्वास से रिपोर्टिंग करने tegral. mitotic कोशिकाओं के एक उच्च संख्या की उपस्थिति, इष्टतम सेल आकारिकी, पर्याप्त confluency, और प्रासंगिक एंटीजन की अभिव्यक्ति विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं. IIF पैटर्न मान्यता रोगी निदान में सहायता करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में कार्य करता है. विभिन्न पैटर्न के महत्व को समझना चिकित्सकों और प्रयोगशाला कर्मियों निदान की पुष्टि करने के लिए उपयुक्त अनुवर्ती परीक्षण प्रदर्शन करने के लिए सक्षम बनाता है. उदाहरण के लिए, सजातीय एना पैटर्न विरोधी dsDNA या chromatin एंटीबॉडी की उपस्थिति में हो सकता है, और प्रणालीगत एक प्रकार का वृक्ष erythematosus (SLE) 3 के साथ जुड़ा हो सकता है. दूसरे पक्ष से, यह हाल ही में सामान्यतः दिनचर्या नमूने के ऊपर से 12% में देखा जाता है कि तथाकथित घने ठीक धब्बेदार पैटर्न (डीएफएस), ज्यादातर विरोधी DFS70 एंटीबॉडी के साथ संबद्ध किया गया है कि वर्णित किया गया है. इन autoantibodies, (अन्य रोग विशेष एना के बिना) अलगाव में पाया जब प्रणालीगत autoimmune आमवाती रोगों के साथ संबद्ध नहीं हैं <> 4-9 समर्थन. विरोधी DFS70 एंटीबॉडी के लिए इस प्रकार पुष्टि परीक्षण, अनावश्यक पलटा परीक्षण कम करने में मदद काफी लागत बचत की पेशकश, और रोगी चिंता कम कर सकते हैं.
IIF autoantibodies पता लगाने के लिए पहली पंक्ति स्क्रीनिंग पद्धति है कि यह देखते हुए, यह उपयोगकर्ता अभिकर्मकों और ऊतक substrates के चयन के परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं कि कैसे समझता है कि सर्वोपरि है. IIF तकनीक स्वाभाविक व्यक्तिपरक है, यह प्रयोग किया अभिकर्मकों उच्चतम गुणवत्ता परिणाम प्रदान जरूरी है.
इस वीडियो प्रोटोकॉल के इस लक्ष्य IIF विधि, एना के साथ जुड़े आम पैटर्न प्रदर्शन करने की जरूरत है सही कदम के साथ उपयोगकर्ता को परिचित करने के लिए, और प्रयोगशाला कार्यप्रवाह को कारगर बनाने और परिणाम मानकीकृत कर सकते हैं जो नई प्रगति का परिचय है.
Screening by HEp-2 cells is a critical first step in the diagnosis of patients with SARD. However, IIF methods lack harmonization. Sources of variability include preparation of slides, conjugate specificity, and efficiency of the fluorescent microscope and experience of the reader. Despite these concerns, IIF remains the “gold standard” for ANA testing. HEp-2 cells contain a large variety of autoantigens, and provide the ideal substrate for the detection of these autoantibodies. In some laboratories, IIF has been replaced with solid phase screening methods such as multiplex assay or ELISA. The shortcoming of such tests is that they do not display the full range of antigens to be sufficiently sensitive. As a consequence, true positive patients may be missed which can have deleterious consequences In addition to the issues of treatment delay and wrong diagnosis, additional healthcare costs may occur due to the repetition of confirmatory tests or unnecessary diagnostic investigations. Given the inherent challenges to IIF, it is paramount to perform this technique properly to avoid subjectivity in results.
To ensure accurate interpretation and reporting of results for ANA screening, it is vital to use the highest quality substrate. When selecting a HEp-2 substrate, it is critical that the cells be optimized to express clinically relevant epitopes in their native protein state. Transfected or otherwise modified HEp-2 cell lines may not allow proper antibody-antigen binding. In addition, when several different autoantibodies are present simultaneously, recombinant cells may mask one or more patterns. High number of mitotic cells should also be present in the substrate. Adequate number of mitotic cells allows quick and accurate identification of patterns.
In addition to the attributes of the substrate, the objective of this video protocol is to describe the IIF technique by showing critical steps such as the addition of sample, slide washing, addition of conjugate, cover slipping, and determination of positive and negative results. Results can be compromised if proper technique is not used for each of these steps. Proper washing is important to remove all unbound antibody. Some patients display very high amounts of autoantibodies and in these cases it is important to wash the serum from the wells such that it does not contaminate other wells.
Although IIF has traditionally been a very labor intensive and subjective laboratory method, new technologies such as slide processors, barcoded slides and automated digital microscopy can greatly simplify the workflow, increase the consistency and reduce the sources of variability of interpretation.
The authors have nothing to disclose.
हम उसे विशेषज्ञ तकनीकी समीक्षा के लिए IIF प्रयोग और कैरोल Buchner प्रदर्शन के लिए Cassandra ब्रायंट धन्यवाद.
NOVA Lite HEp-2 IgG (DAPI conjugate) | INOVA Diagnostics | 708102 | |
NOVA View Instrument | INOVA Diagnostics | NV2000 | |
QUANTA Link Workstation | INOVA Diagnostics | LINK010 | |
QUANTA Link Workstation License | INOVA Diagnostics | LINK001 | |
Barcode Scanner | INOVA Diagnostics | LINK019 |