منصة ميكروفلويديك الانجذاب الكيميائي لقياس العدلات من الدم غير المجهزة الجامعة
Summary
هذا البروتوكول تفاصيل مقايسة مصممة لقياس الكيميائي العدلة الإنسان من قطرة واحدة من الدم الكامل مع استنساخ قوية. هذا النهج تلتف على ضرورة الفصل العدلة ويتطلب بضع دقائق فقط من الوقت اللازم لإعداد مقايسة. رقاقة ميكروفلويديك تمكن التدبير المتكررة الكيميائي العدلة مع مرور الوقت في الرضع أو الثدييات الصغيرة، حيث حجم العينة محدودة.
Abstract
العدلات تلعب دورا أساسيا في الحماية ضد الالتهابات وأعدادهم في الدم في كثير من الأحيان يتم قياس في العيادة. عدد العدلات العالي في الدم وعادة ما تكون مؤشرا على العدوى الجارية، في حين التهم العدلة المنخفضة هي علامة تحذير لمخاطر أكبر للعدوى. لإنجاز مهامهم، يكون العدلات أيضا أن تكون قادرة على التحرك بشكل فعال من الدم حيث يقضون معظم حياتهم، إلى أنسجة، حيث تحدث العدوى. وبالتالي، يمكن أي عيوب في قدرة العدلات لترحيل زيادة مخاطر للعدوى، حتى عندما تكون موجودة بأعداد مناسبة في الدم العدلات. ومع ذلك، وقياس القدرة الهجرة العدلة في العيادة هي مهمة صعبة، والتي تستغرق وقتا طويلا، ويتطلب كمية كبيرة من الدم، ومعرفة الخبراء. لمعالجة هذه القيود، قمنا بتصميم المقايسات ميكروفلويديك قوية للهجرة العدلات، الأمر الذي يتطلب قطرة واحدة من الدم غير المجهزة، يلتصقفتحات الحاجة لفصل العدلة، وسهلة لقياس على المجهر بسيطة. في هذا الاختبار، العدلات تهاجر مباشرة من قطرات الدم، من خلال قنوات صغيرة، نحو مصدر جاذب كيميائي. لمنع تدفق الحبيبية من خلايا الدم الحمراء من خلال نفس القنوات، ونفذنا المرشحات الميكانيكية مع زاوية الحق يتحول التي تمنع بشكل انتقائي تقدم خلايا الدم الحمراء. نحن التحقق من صحة الفحص بمقارنة الهجرة العدلة من قطرات الدم التي تم جمعها من وخز الإصبع والدم الوريدي. نحن أيضا مقارنة هذه الدم الكامل (WB) مصادر الهجرة العدلة من عينات من العدلات المنقى وجدت سرعة ثابتة والاتجاهية بين المصادر الثلاثة. وهذه المنصة ميكروفلويديك تمكين دراسة الهجرة العدلات الإنسان في العيادة وإعداد البحوث للمساعدة في دفع فهمنا من وظائف العدلات في الصحة والمرض.
Introduction
الاتجار العدلة يلعب دورا حاسما في تحديد التقدم وحسم العديد من حالات الالتهابات، بما في ذلك تصلب الشرايين 1، عدوى بكتيرية أو الإنتان 2، وحرق إصابة 3. للمساهمة كبرى لشروط الصحة والمرض، عدد العدلات هو جزء من تحليل الدم القياسية غالبا ما يعتبر في المختبرات السريرية والبحوث. ومع ذلك، على الرغم من كونها واحدة من التجارب الأكثر انتشارا، وقيمة عدد العدلات في تشخيص العدوى والإنتان قد شكك في كثير من الأحيان 4. على سبيل المثال، كشفت دراسة واحدة من العدلات في مرضى الحروق التي العد العدلة والعدلة وظيفة الهجرة لا ترتبط؛ مما يدل على أن العدلات العد وحده ليس مؤشرا دقيقا لحالة المناعة 3. على الرغم من صعوبة قياس، وقد اقترح العدلة الكفاءة الوظيفية على أنها أكثر قيمة في مجموعة واسعة من الظروف.
ر "> الأهم من ذلك، العديد من العيوب العدلات عابرة وليست ناجمة عن عيوب وراثية دائمة، وهو التمييز الذي تم تجاهله إلى حد كبير في العيادة حتى وقت قريب. وفي سياق إصابات الحروق، ويمكن رصد هجرة العدلات أثناء علاج المريض كمؤشر على حالة التهابات أو عدوى 3. لا يمكن ترجمتها المقايسات الهجرة التقليدية المستخدمة حاليا في المختبر (غرفة بويدن، وغرفة دن، مقايسة micropipette) في عملية إعداد سريرية لأنها تتطلب كميات كبيرة من الدم ومرهقة تستغرق وقتا طويلا تقنيات العدلة العزلة (الجدول 1). أيضا لا يمكن أن تستخدم هذه المقايسات لرصد التغيرات عابرة في الكيميائي العدلة في الحيوانات المختبرية الصغيرة، مثل الفئران، وذلك لأن حجم الدم اللازمة لالعدلة العزلة يسمح لعينة واحدة فقط، وغالبا ما حتى يتطلب تجميع الدم من الحيوانات متعددة لفحص واحد، فعلى سبيل المثال، دراسة شملت مالشروط والعلاجات ضافة عدة على عدة نقاط في الوقت يحتمل أن تتطلب الآلاف من الفئران باستخدام المقايسات الكيميائي الحالي. هذا يحد من البحوث البيولوجية الأساسية التي يمكن القيام به لفهم ديناميات معقدة من وظيفة المناعة في سياق إصابات أو عدوى أو حرق غالبا ما درس في نماذج الفئران 5.لتلبية الحاجة لفحص وظيفي العدلة التي هي سريعة وقوية، في حين تتطلب الحد الأدنى من حجم الدم، قمنا بتطوير جهاز ميكروفلويديك الذي يقيس الكيميائي العدلة مباشرة من قطرات صغيرة من الدم الكامل. من المعروف أن العديد من العوامل في الدم كله، بما في ذلك المصل 6 و 7 الصفائح الدموية، تؤثر على وظيفة العدلات. ولذلك فمن المفيد أن كل مقايسة ميكروفلويديك الدم يقلل تجهيز العينات للحفاظ على المكروية في الجسم الحي من العدلات عند قياس التغيرات في الكيميائي مع المختبر في فحص 8. هذا النهجيقلل من الوقت من جمع الدم إلى العدلة المقايسات الهجرة من ساعة باستخدام التقنيات التقليدية، لدقائق معدودة فقط (الجدول 1). منصة ميكروفلويديك الدم الكامل تنتج استقرارا التدرج جاذب كيميائي خطي لطول التجربة، لا يوجد لديه أجزاء متحركة، ولا يتطلب مصدر الضغط الخارجي (أي ضخ حقنة). الميزة الرئيسية في تصميم كامل الجهاز ميكروفلويديك الدم هو إدماج خلية الدم الحمراء (RBC) مشط الترشيح أن يرشح ميكانيكيا كرات الدم الحمراء من دخول القناة الهجرة من الجهاز. يتحول حق هذا الترشيح مشط حيلولة دون الحاجة لترشيح حجم الإقصاء، والتي من المرجح أن يكون انسداد بواسطة كرات الدم الحمراء، وبالتالي منع التدرج جاذب كيميائي من الوصول إلى العدلات المهاجرة بنشاط في الضفة الغربية. إدماج كامل الجهاز ميكروفلويديك الدم في لوحة 12 أو 24 أيضا يسهل فحص وسطاء متعددة من الاشتراكية العدلات الكيميائي الإنسان أو الفئرانmultaneously.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا العمل، قمنا بتطوير منصة ميكروفلويديك لقياس العدلات الكيميائي من قطرات من الدم (2 ميكرولتر). الترشيح الميكانيكي للكرات الدم الحمراء على رقاقة من الهجرة بنشاط العدلات تلتف الحاجة إلى أساليب مرهقة فصل الخلية مثل كثافة التدرجات 10، واختيار الإيجابي 11، …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
بدعم من المعاهد الوطنية للصحة (GM092804 يمنح، DE019938) ومستشفى شرينرس بيرنز.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Device Fabrication | |||
| SU8 | Microchem | Y131273 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 1.1 lb. Kit | |
| Standard glass slides | Fisher Scientific | 125495 | 1 X 3 inches |
| Glass-bottom plate | MatTek | P12G-1.5-14-F | |
| Harris Uni-Core, Tip Diameter 5.0mm | Ted Pella, Inc. | 15081 | |
| Harris Uni-Core, Tip Diameter 1.5 mm | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Microfluidic Assay Preparation and Analysis | |||
| Gel-loading pipet tip | Fisher Scientific | 02-707-139 | |
| Syringe | Fisher Scientfic | 309602 | |
| Blunt tip needle, 30g ½ in. | Brico Medical Supply | BN3005 | |
| Vacutainer, Heparin | Becton Dickinson | ||
| HBSS | Sigma-Aldrich | ||
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A5843-5G | 0.2% final concentration in HBSS |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895-1MG | |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506-10MG | |
| SurgiLance safety lancet, 2.2mm depth, 22 gauge | SLN240 | ||
| Hoescht stain | Life Technologies | H3570 | |
| Positive Control | |||
| HetaSep | STEMCELL Technologies Inc. | 7906 | |
| EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit | STEMCELL Technologies Inc. | 19257 | |
| Equipment | |||
| Plasma Asher | March Instruments | P-250 | |
| Lindberg/Blue M Oven | Thermo Scientific | 13-258-30C | |
| Stainless Steel Precision Tweezers | Techni Tool | 758TW458 | |
| Bel-Art Scienceware Chemical-Resistant Vacuum Desiccator | Fisher Scientific | 08-594-15A | |
| Dataplate Digital Hot Plate | Alpha Multiservices | PMC 720 | |
| Nikon TiE inverted microscope | Nikon – Micro Video Instruments Inc. | MEA53100 | |
| CFI Plan Fluor DL 10x na 15.2wd Objective | Nikon – Micro Video Instruments Inc. | MRH20101 | |
| Lumen 200 with 2 Meter Light Guide for Nikon | Nikon – Micro Video Instruments Inc. | 500-L200NI2 | |
| DAPI/Hoechst/AMCA Narrow Band 32mm Exciters – 25mm Emitters | Chroma – Micro Video Instruments Inc. | 31013v2 | |
| Retiga R 2000 cooled CCD Camera 1600×1200 pixels | Qimaging – Micro Video Instruments Inc. | RET-2000R-F-M-12-C |
Riferimenti
- Hansson, G. K., Robertson, A. K., Soderberg-Naucler, C. Inflammation and atherosclerosis. Annual review of pathology. 1, 297-329 (2006).
- Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nature medicine. 17, 1381-1390 (2011).
- Butler, K. L., et al. Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices. PloS one. 5, (2010).
- Lavrentieva, A., et al. Inflammatory markers in patients with severe burn injury. What is the best indicator of sepsis. Burns : journal of the International Society for Burn Injuries. 33, 189-194 (2007).
- De Filippo, K., et al. Mast cell and macrophage chemokines CXCL1/CXCL2 control the early stage of neutrophil recruitment during tissue inflammation. Blood. 121, 4930-4937 (2013).
- Mankovich, A. R., Lee, C. Y., Heinrich, V. Differential effects of serum heat treatment on chemotaxis and phagocytosis by human neutrophils. PloS one. 8, (2013).
- Palabrica, T., et al. Leukocyte accumulation promoting fibrin deposition is mediated in vivo by P-selectin on adherent platelets. Nature. 359, 848-851 (1992).
- Sackmann, E. K., et al. Microfluidic kit-on-a-lid: a versatile platform for neutrophil chemotaxis assays. Blood. 120, (2012).
- Jones, C. N., et al. Microfluidic chambers for monitoring leukocyte trafficking and humanized nano-proresolving medicines interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 20560-20565 (2012).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods Mol Biol. 412, 15-20 (2007).
- Lyons, P. A., et al. Microarray analysis of human leucocyte subsets: the advantages of positive selection and rapid purification. BMC genomics. 8, (2007).
- Hasenberg, M., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PloS one. 6, (2011).
- Agrawal, N., Toner, M., Irimia, D. Neutrophil migration assay from a drop of blood. Lab on a chip. 8, 2054-2061 (2008).
- Hoang, A. N., et al. Measuring neutrophil speed and directionality during chemotaxis, directly from a droplet of whole blood. Technology. , 1-9 (2013).
- Kurihara, T., et al. Resolvin D2 restores neutrophil directionality and improves survival after burns. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. , (2013).
- Buffone, V., Meakins, J. L., Christou, N. V. Neutrophil function in surgical patients. Relationship to adequate bacterial defenses. Arch Surg. 119, 39-43 (1984).
- Malawista, S. E., de Boisfleury Chevance, A., van Damme, J., Serhan, C. N. Tonic inhibition of chemotaxis in human plasma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 17949-17954 (2008).
