Unprocessed पूरे रक्त से न्युट्रोफिल Chemotaxis मापने के लिए मंच microfluidic
Summary
इस प्रोटोकॉल मजबूत reproducibility के साथ पूरे रक्त की एक छोटी बूंद से मानव न्युट्रोफिल chemotaxis को मापने के लिए बनाया गया एक परख विवरण. यह दृष्टिकोण न्युट्रोफिल जुदाई के लिए की जरूरत में गतिरोध उत्पन्न और परख तैयारी के समय के कुछ ही मिनट की आवश्यकता है. microfluidic चिप शिशुओं या नमूना मात्रा सीमित है जहां छोटे स्तनपायी, में समय के साथ न्युट्रोफिल chemotaxis के दोहराया उपाय सक्षम बनाता है.
Abstract
न्यूट्रोफिल रक्त में संक्रमण और उनकी संख्या के खिलाफ संरक्षण में एक आवश्यक भूमिका निभाते अक्सर क्लिनिक में मापा जाता है. कम न्युट्रोफिल मायने रखता संक्रमण के लिए उच्च जोखिम के लिए एक चेतावनी के संकेत हैं, जबकि रक्त में उच्च न्युट्रोफिल मायने रखता है, आम तौर पर चल रहे संक्रमण का सूचक हैं. उनके कार्यों को पूरा करने के लिए, neutrophils भी संक्रमण होते हैं जहां ऊतकों में, वे अपने जीवन के सबसे अधिक खर्च जहां खून से प्रभावी ढंग से ले जाने के लिए सक्षम होना चाहिए. नतीजतन, विस्थापित करने के लिए neutrophils की क्षमता में कोई दोष neutrophils रक्त में उचित संख्या में मौजूद हैं, तब भी जब संक्रमण के लिए जोखिम को बढ़ा सकते हैं. हालांकि, क्लिनिक में न्युट्रोफिल प्रवास क्षमता को मापने, समय लेने वाली है, जो एक चुनौती भरा काम है, बड़े रक्त की मात्रा, और विशेषज्ञ ज्ञान की आवश्यकता है. इन सीमाओं का पता करने के लिए, हम परिस्थितियों, unprocessed रक्त की एक छोटी बूंद की आवश्यकता है, जो न्युट्रोफिल प्रवास के लिए एक मजबूत microfluidic assays बनाया गयान्युट्रोफिल जुदाई के लिए की जरूरत vents, और एक साधारण माइक्रोस्कोप पर यों के लिए आसान है. इस परख में, neutrophils chemoattractant के स्रोत की ओर, छोटे चैनलों के माध्यम से, रक्त छोटी बूंद से सीधे चले जाते हैं. एक ही चैनल के माध्यम से लाल रक्त कोशिकाओं की बारीक प्रवाह को रोकने के लिए, हम चुनिंदा लाल रक्त कोशिकाओं की अग्रिम कि ब्लॉक बदल जाता है सही कोण के साथ यांत्रिक फिल्टर लागू किया है. हम उंगली चुभन और शिरापरक रक्त से एकत्र रक्त बूंदों से न्युट्रोफिल प्रवास तुलना करके परख मान्य. हम भी शुद्ध neutrophils के नमूनों से न्युट्रोफिल प्रवास के साथ इन पूरे रक्त (पश्चिम बंगाल) के सूत्रों की तुलना में और तीन स्रोतों के बीच लगातार गति और दिशात्मकता पाया. इस मंच microfluidic स्वास्थ्य और रोग में न्युट्रोफिल कार्यों के बारे में हमारी समझ अग्रिम में मदद करने के लिए क्लिनिक और अनुसंधान सेटिंग में मानव न्युट्रोफिल प्रवास के अध्ययन के लिए सक्षम हो जाएगा.
Introduction
न्युट्रोफिल तस्करी atherosclerosis 1, जीवाणु संक्रमण या पूति 2 सहित कई भड़काऊ शर्तों, की प्रगति और संकल्प का निर्धारण करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और चोट 3 जला. स्वास्थ्य और बीमारी की स्थिति के लिए अपने प्रमुख योगदान के लिए, न्युट्रोफिल गिनती अक्सर नैदानिक और अनुसंधान प्रयोगशालाओं में माना मानक रक्त विश्लेषण का हिस्सा है. हालांकि, सबसे सर्वव्यापी परीक्षणों में से एक, संक्रमण और पूति के निदान में न्युट्रोफिल गिनती के मूल्य होने के बावजूद अक्सर 4 पूछताछ की गई है. उदाहरण के लिए, रोगियों को जलाने में neutrophils के एक अध्ययन न्युट्रोफिल गिनती और न्युट्रोफिल प्रवास समारोह सहसंबंधी नहीं है कि पता चला; कि न्युट्रोफिल अकेले गिनती वाचक प्रतिरक्षा स्थिति 3 का सही संकेत नहीं है. मापने के लिए और अधिक कठिन है, न्युट्रोफिल कार्यात्मक क्षमता स्थितियों की एक विस्तृत रेंज में अधिक मूल्यवान के रूप में प्रस्तावित किया गया है.
टी "> महत्वपूर्ण बात है, न्युट्रोफिल दोष के कई क्षणिक हैं और स्थायी आनुवंशिक दोष, मोटे तौर पर हाल ही में जब तक क्लिनिक में अनदेखी की गई है कि एक अंतर से चालू होने वाले नहीं हैं. जला चोटों के संदर्भ में, न्युट्रोफिल प्रवास के दौरान नजर रखी जा सकता है भड़काऊ स्थिति या संक्रमण 3 के एक संकेत के रूप में एक मरीज के उपचार वे रक्त की बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है. वर्तमान में प्रयोगशाला (Boyden कक्ष, डन कक्ष, micropipette परख) में इस्तेमाल किया पारंपरिक प्रवास assays एक नैदानिक सेटिंग में अनुवाद नहीं किया जा सकता और बोझिल समय लेने वाली न्युट्रोफिल अलगाव के लिए आवश्यक रक्त की मात्रा केवल एक नमूना के लिए अनुमति देता है और अक्सर भी पूलिंग की आवश्यकता है क्योंकि न्युट्रोफिल अलगाव तकनीक (1 टेबल). ये assays भी, चूहों जैसे छोटे पशु प्रयोगशाला में न्युट्रोफिल chemotaxis में क्षणिक परिवर्तन की निगरानी करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता एक एकल परख के लिए कई जानवरों से खून. उदाहरण के लिए, शामिल अध्ययन एमकई समय अंक से अधिक एकाधिक शर्तों और उपचार के संभावित वर्तमान chemotaxis assays का उपयोग चूहों के हजारों की आवश्यकता सकता है. इस चोट, संक्रमण के संदर्भ में प्रतिरक्षा समारोह की जटिल गतिशीलता को समझने या अक्सर murine मॉडल 5 में अध्ययन जलाने के लिए किया जा सकता है कि बुनियादी जैविक अनुसंधान प्रतिबंधित करता है.कम से कम रक्त की मात्रा की आवश्यकता होती है, जबकि तेजी से मजबूत है कि एक न्युट्रोफिल कार्यात्मक परख की आवश्यकता का पता करने के लिए, हम पूरे रक्त का एक छोटा सा छोटी बूंद से सीधे न्युट्रोफिल chemotaxis उपाय है कि एक microfluidic युक्ति को विकसित किया है. यह सीरम 6 और प्लेटलेट्स 7 सहित पूरे रक्त में कई कारकों, न्युट्रोफिल समारोह को प्रभावित कर सकता है. यह पूरे रक्त microfluidic परख इन विट्रो परख 8 के साथ chemotaxis में बदलाव को मापने जब न्युट्रोफिल के vivo microenvironment बनाए रखने के लिए नमूना प्रसंस्करण कि कम से कम इसलिए फायदेमंद है. यह दृष्टिकोणरक्त संग्रह से परंपरागत तकनीक का उपयोग घंटे से न्युट्रोफिल प्रवास assays के लिए समय कम कर देता है बस मिनट (तालिका 1) के लिए. पूरे रक्त microfluidic मंच, प्रयोग की लंबाई के लिए एक स्थिर रेखीय chemoattractant ढाल का उत्पादन नहीं चलती भागों है, और एक बाहरी दबाव स्रोत (यानी सिरिंज पंप) की आवश्यकता नहीं है. पूरे रक्त microfluidic डिवाइस के डिजाइन में प्रमुख विशेषता यंत्रवत् डिवाइस के प्रवास चैनल में प्रवेश करने से लाल रक्त कोशिकाओं कि फिल्टर एक लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) निस्पंदन कंघी का समावेश है. इस निस्पंदन कंघी के दाएँ मुड़ता संभावना लाल रक्त कोशिकाओं से भरा किया जाएगा जो आकार अपवर्जन निस्पंदन, के लिए की जरूरत को रोकने और इसलिए पश्चिम बंगाल में सक्रिय रूप से पलायन neutrophils तक पहुँचने से chemoattractant ढाल ब्लॉक. एक 12 या 24 अच्छी तरह से थाली में पूरे रक्त microfluidic डिवाइस का समावेश मानव या murine न्युट्रोफिल chemotaxis सी के कई मध्यस्थों की स्क्रीनिंग की सुविधाmultaneously.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस काम में, हम खून की एक छोटी बूंद (2 μl) से न्युट्रोफिल chemotaxis को मापने के लिए एक microfluidic मंच विकसित की है. सक्रिय रूप से neutrophils पलायन से लाल रक्त कोशिकाओं की चिप पर यांत्रिक निस्पंदन neutrophils सक्रिय द्वारा कलाकृतियों ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान से समर्थन और श्राइनर्स बर्न्स अस्पताल (GM092804, DE019938 अनुदान).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Device Fabrication | |||
| SU8 | Microchem | Y131273 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 1.1 lb. Kit | |
| Standard glass slides | Fisher Scientific | 125495 | 1 X 3 inches |
| Glass-bottom plate | MatTek | P12G-1.5-14-F | |
| Harris Uni-Core, Tip Diameter 5.0mm | Ted Pella, Inc. | 15081 | |
| Harris Uni-Core, Tip Diameter 1.5 mm | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Microfluidic Assay Preparation and Analysis | |||
| Gel-loading pipet tip | Fisher Scientific | 02-707-139 | |
| Syringe | Fisher Scientfic | 309602 | |
| Blunt tip needle, 30g ½ in. | Brico Medical Supply | BN3005 | |
| Vacutainer, Heparin | Becton Dickinson | ||
| HBSS | Sigma-Aldrich | ||
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A5843-5G | 0.2% final concentration in HBSS |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895-1MG | |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506-10MG | |
| SurgiLance safety lancet, 2.2mm depth, 22 gauge | SLN240 | ||
| Hoescht stain | Life Technologies | H3570 | |
| Positive Control | |||
| HetaSep | STEMCELL Technologies Inc. | 7906 | |
| EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit | STEMCELL Technologies Inc. | 19257 | |
| Equipment | |||
| Plasma Asher | March Instruments | P-250 | |
| Lindberg/Blue M Oven | Thermo Scientific | 13-258-30C | |
| Stainless Steel Precision Tweezers | Techni Tool | 758TW458 | |
| Bel-Art Scienceware Chemical-Resistant Vacuum Desiccator | Fisher Scientific | 08-594-15A | |
| Dataplate Digital Hot Plate | Alpha Multiservices | PMC 720 | |
| Nikon TiE inverted microscope | Nikon – Micro Video Instruments Inc. | MEA53100 | |
| CFI Plan Fluor DL 10x na 15.2wd Objective | Nikon – Micro Video Instruments Inc. | MRH20101 | |
| Lumen 200 with 2 Meter Light Guide for Nikon | Nikon – Micro Video Instruments Inc. | 500-L200NI2 | |
| DAPI/Hoechst/AMCA Narrow Band 32mm Exciters – 25mm Emitters | Chroma – Micro Video Instruments Inc. | 31013v2 | |
| Retiga R 2000 cooled CCD Camera 1600×1200 pixels | Qimaging – Micro Video Instruments Inc. | RET-2000R-F-M-12-C |
Riferimenti
- Hansson, G. K., Robertson, A. K., Soderberg-Naucler, C. Inflammation and atherosclerosis. Annual review of pathology. 1, 297-329 (2006).
- Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nature medicine. 17, 1381-1390 (2011).
- Butler, K. L., et al. Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices. PloS one. 5, (2010).
- Lavrentieva, A., et al. Inflammatory markers in patients with severe burn injury. What is the best indicator of sepsis. Burns : journal of the International Society for Burn Injuries. 33, 189-194 (2007).
- De Filippo, K., et al. Mast cell and macrophage chemokines CXCL1/CXCL2 control the early stage of neutrophil recruitment during tissue inflammation. Blood. 121, 4930-4937 (2013).
- Mankovich, A. R., Lee, C. Y., Heinrich, V. Differential effects of serum heat treatment on chemotaxis and phagocytosis by human neutrophils. PloS one. 8, (2013).
- Palabrica, T., et al. Leukocyte accumulation promoting fibrin deposition is mediated in vivo by P-selectin on adherent platelets. Nature. 359, 848-851 (1992).
- Sackmann, E. K., et al. Microfluidic kit-on-a-lid: a versatile platform for neutrophil chemotaxis assays. Blood. 120, (2012).
- Jones, C. N., et al. Microfluidic chambers for monitoring leukocyte trafficking and humanized nano-proresolving medicines interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 20560-20565 (2012).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods Mol Biol. 412, 15-20 (2007).
- Lyons, P. A., et al. Microarray analysis of human leucocyte subsets: the advantages of positive selection and rapid purification. BMC genomics. 8, (2007).
- Hasenberg, M., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PloS one. 6, (2011).
- Agrawal, N., Toner, M., Irimia, D. Neutrophil migration assay from a drop of blood. Lab on a chip. 8, 2054-2061 (2008).
- Hoang, A. N., et al. Measuring neutrophil speed and directionality during chemotaxis, directly from a droplet of whole blood. Technology. , 1-9 (2013).
- Kurihara, T., et al. Resolvin D2 restores neutrophil directionality and improves survival after burns. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. , (2013).
- Buffone, V., Meakins, J. L., Christou, N. V. Neutrophil function in surgical patients. Relationship to adequate bacterial defenses. Arch Surg. 119, 39-43 (1984).
- Malawista, S. E., de Boisfleury Chevance, A., van Damme, J., Serhan, C. N. Tonic inhibition of chemotaxis in human plasma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 17949-17954 (2008).
