Microfluidic plattform for måling Neutrofil Chemotaxis fra Ubehandlet Whole Blood

Summary

Denne protokollen detaljer en assay utviklet for å måle human neutrofil kjemotakse av en dråpe av helblod med robust reproduserbarhet. Denne tilnærmingen omgår behovet for nøytrofile separasjon og krever bare noen få minutter av analysen forberedelsestid. Den microfluidic brikken gjør det mulig for den gjentatte mål på nøytrofil-kjemotakse over tid hos spedbarn og små pattedyr, hvor prøvevolum er begrenset.

Abstract

Nøytrofiler spiller en vesentlig rolle i beskyttelse mot infeksjoner og deres antall i blodet blir ofte målt i klinikken. Høyere nøytrofile granulocytter i blodet er vanligvis en indikator på pågående infeksjoner, mens lavt antall nøytrofile granulocytter er et faresignal for høyere risiko for infeksjoner. For å oppnå sine funksjoner, nøytrofile må også være i stand til å bevege seg effektivt fra blodet, hvor de tilbringer mesteparten av sitt liv, i vev, der infeksjoner oppstår. Følgelig kan enhver defekt i evnen til neutrofiler til å migrere øke risikoen for infeksjoner, selv når nøytrofile celler er til stede i passende antall i blodet. Men måling nøytrofile migrasjon evne i klinikken er en utfordrende oppgave, som er tidkrevende, krever stor mengde blod, og ekspertkunnskap. For å møte disse begrensningene, utviklet vi en robust microfluidic analyser for nøytrofile migrasjon, noe som krever en eneste dråpe med ubehandlet blod, circumventiler behovet for nøytrofil-separasjon, og er lett å kvantifisere på en enkel mikroskop. I dette assay, neutrofiler vandrer direkte fra bloddråpen, gjennom små kanaler, mot kilden chemoattractant. For å hindre at det granulære strømmen av røde blodlegemer gjennom de samme kanaler, gjennomførte vi mekaniske filtre med rett vinkel svinger som selektivt blokkerer forkant av røde blodceller. Vi bekreftet analysen ved å sammenligne nøytrofil migrering fra bloddråper som samles fra finger stikk-og veneblod. Vi har også sammenlignet disse fullblod (WB) kilder med nøytrofile migrasjon fra prøver av renset nøytrofile og funnet konsistent hastighet og retningen mellom de tre kildene. Dette microfluidic plattformen vil gjøre studiet av menneskelige nøytrofile migrasjon i klinikken og forskningen innstillingen for å hjelpe fremme vår forståelse av nøytrofile funksjoner i helse og sykdom.

Introduction

Nøytrofile trafficking spiller en avgjørende rolle i å bestemme fremdriften og oppløsning av mange inflammatoriske tilstander, inkludert aterosklerose ^1, bakteriell infeksjon eller sepsis ^to, og brannskader ^tre. For sitt store bidrag til helse-og sykdomstilstander, er nøytrofile granulocytter del av standardblodanalyse ofte sett i kliniske og forskningslaboratorier. Men, til tross for å være en av de mest utbredte tester, verdien av nøytrofile granulocytter i diagnostikk av infeksjon og sepsis har vært hyppig avhørt ^fire. For eksempel, en studie av nøytrofile i brannskadepasienter viste at antall nøytrofile og nøytrofile migrasjon funksjon ikke korrelerer; som betyr at de nøytrofile alene er ikke en nøyaktig indikator på immunstatus ^tre. Selv om mer vanskelig å måle, har nøytrofile funksjonell kompetanse blitt foreslått som mer verdifulle i et bredt spekter av betingelser.

t "> Viktigere, mange av nøytrofile defekter er forbigående og er ikke utløst av permanente genetiske defekter, en utmerkelse som har vært i stor grad oversett i klinikken inntil nylig. I sammenheng med brannskader, kunne nøytrofile migrasjon overvåkes i løpet av en pasients behandlings som en indikator på inflammatorisk status eller infeksjoner ^3. vanlige vandrings assays som brukes i laboratoriet (Boyden kammer, Dunn kammer, mikropipette assay) ikke kan oversettes til en klinisk setting, fordi de krever store mengder blod og tungvint tidkrevende nøytrofil isolasjonsteknikker (tabell 1). disse assays kan heller ikke brukes til å overvåke transiente forandringer i nøytrofil-kjemotakse i små laboratoriedyr, for eksempel mus, fordi volumet av blod som er nødvendig for nøytrofil isolasjon gjør det mulig for bare én prøve, og ofte til og med krever kontinuitets blod fra flere dyr, for en enkelt analyse. For eksempel, en studie som involverte multiple tilstander og behandlinger over flere tidspoeng potensielt kan kreve tusenvis av mus med dagens chemotaxis analyser. Dette begrenser den grunnleggende biologiske undersøkelser som kan gjøres for å forstå de komplekse dynamikken til immunfunksjon i sammenheng med skade, infeksjon eller brennes ofte er studert i murine modeller ^5.

For å møte behovet for en nøytrofil funksjonelt assay som er rask og robust, samtidig som den krever minimal blodvolum, har vi utviklet en mikrofluidteknisk enhet som måler nøytrofil kjemotakse direkte fra en liten dråpe av helblod. Det er kjent at mange faktorer i fullblod, inkludert serum ⁶ og blodplater ^7, påvirke nøytrofil-funksjon. Det er derfor fordelaktig at hele blodmikrofluid assay minimerer prøvebehandling for å opprettholde in vivo mikromiljøet av nøytrofile ved måling av variasjoner i chemotaxis med et in vitro assay ^8. Denne tilnærmingenreduserer tiden fra blodprøvetaking til nøytrofile migrasjon essay fra timer ved hjelp av tradisjonelle teknikker, til bare noen minutter (Tabell 1). Hele blod microfluidic plattformen produserer en stabil lineær gradient kjemoattraktant for lengden av forsøket, har ingen bevegelige deler og krever ikke en ekstern trykkilde (dvs. sprøytepumpe). Det sentrale trekk i utformingen av helblod microfluidic enhet er inkorporering av en rød blodcelle (RBC) filtrering kam som mekanisk filter RBCs fra å komme inn i kanalen migrering av enheten. De riktige svinger av denne filtrerings kam hindre behovet for størrelse utelukkelse filtrering, noe som trolig ville bli tilstoppet av RBC og dermed blokkere kjemoattraktant gradient fra å nå aktivt migrere nøytrofile i WB. Inkorporering av helblod microfluidic enhet i en 12 eller 24 brønns plate letter screening av flere mediatorer for human eller murin neutrofil kjemotakse SImultaneously.

Protocol

En. Microfluidic Device Fabrication Ved hjelp av standard fotolitografiske teknikker, og lag master formskive i et klasse 1000 rent rom. Mønster den første 3-mikrometer tynne epoxy-basert negative fotoresistsjiktet å definere migrasjonskanaler i henhold til instruksjonene fra produsenten. Mønster den andre 50-mikrometer tykt lag for å definere celle-lasting og chemokine kamre. Bruk mønstrede wafer å kaste polydimethylsiloxane (PDMS) enheter. Kraft bland PDMS (20 g) med initiator (2 g) i 5 min…

Representative Results

Hele blod (WB) nøytrofile kjemotaxis analysen ble validert ved å måle akkumulering av nøytrofile mot en fMLP gradient (Movie S1). Resultatene bekrefter at RBC-fanges av filtrering kammen mens nøytrofiler (blå) er i stand til å migrere aktivt av helt blod (fig. 3A og film S1). Den stabile lineær kjemotiltrekkende gradient (grønn) som er dannet av helt blod microfluidic enhet ble bekreftet ved bruk av FITC-merket dekstran (figur 3A innfelt) og m?…

Discussion

I dette arbeidet har vi utviklet en microfluidic plattform for å måle nøytrofile chemotaxis fra en dråpe med blod (2 mL). De on-chip mekanisk filtrering av RBCs fra aktivt migrere nøytrofiler omgår behovet for tungvinte celleseparasjonsmetoder slik som tetthetsgradienter ^10, positiv utvelgelse ^11, eller negativ seleksjon ^12, som er tilbøyelige til å innføre artifakter ved å aktivere neutrofiler. Den mekanisk filtrering av RBC skiller vår teknologi fra andre microfluidic chips …

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Device Fabrication
SU8	Microchem	Y131273
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Ellsworth Adhesives	Sylgard 184 1.1 lb. Kit
Standard glass slides	Fisher Scientific	125495	1 X 3 inches
Glass-bottom plate	MatTek	P12G-1.5-14-F
Harris Uni-Core, Tip Diameter 5.0mm	Ted Pella, Inc.	15081
Harris Uni-Core, Tip Diameter 1.5 mm	Ted Pella, Inc.	15072
Microfluidic Assay Preparation and Analysis
Gel-loading pipet tip	Fisher Scientific	02-707-139
Syringe	Fisher Scientfic	309602
Blunt tip needle, 30g ½ in.	Brico Medical Supply	BN3005
Vacutainer, Heparin	Becton Dickinson
HBSS	Sigma-Aldrich
Human serum albumin	Sigma-Aldrich	A5843-5G	0.2% final concentration in HBSS
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F0895-1MG
fMLP	Sigma-Aldrich	F3506-10MG
SurgiLance safety lancet, 2.2mm depth, 22 gauge		SLN240
Hoescht stain	Life Technologies	H3570
Positive Control
HetaSep	STEMCELL Technologies Inc.	7906
EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit	STEMCELL Technologies Inc.	19257
Equipment
Plasma Asher	March Instruments	P-250
Lindberg/Blue M Oven	Thermo Scientific	13-258-30C
Stainless Steel Precision Tweezers	Techni Tool	758TW458
Bel-Art Scienceware Chemical-Resistant Vacuum Desiccator	Fisher Scientific	08-594-15A
Dataplate Digital Hot Plate	Alpha Multiservices	PMC 720
Nikon TiE inverted microscope	Nikon – Micro Video Instruments Inc.	MEA53100
CFI Plan Fluor DL 10x na 15.2wd Objective	Nikon – Micro Video Instruments Inc.	MRH20101
Lumen 200 with 2 Meter Light Guide for Nikon	Nikon – Micro Video Instruments Inc.	500-L200NI2
DAPI/Hoechst/AMCA Narrow Band 32mm Exciters – 25mm Emitters	Chroma – Micro Video Instruments Inc.	31013v2
Retiga R 2000 cooled CCD Camera 1600×1200 pixels	Qimaging – Micro Video Instruments Inc.	RET-2000R-F-M-12-C