Mikroflödes Plattform för Mätning Neutrophil Chemotaxis från Cement helblod
Summary
Detta protokoll detaljer en analys som syftar till att mäta human neutrofil kemotaxi från en droppe helblod med robust reproducerbarhet. Detta tillvägagångssätt kringgår behovet av neutrofila separation och kräver bara några minuter av analys förberedelsetid. Den mikroflödessystem chip möjliggör upprepade mått på neutrofila kemotaxi över tid hos spädbarn eller små däggdjur, där provvolym är begränsad.
Abstract
Neutrofiler spelar en viktig roll i försvaret mot infektioner och deras nummer i blodet ofta mäts i kliniken. Högre neutrofila granulocyter i blodet är oftast ett tecken på pågående infektioner, medan lågt antal neutrofila granulocyter är en varningssignal för högre risker för infektioner. För att utföra sina uppgifter, neutrofiler måste också kunna röra sig effektivt från blodet där de tillbringar större delen av sitt liv, in i vävnader, där infektioner uppstå. Följaktligen kan eventuella defekter i förmågan hos neutrofiler att migrera öka riskerna för infektioner, även när neutrofiler är närvarande i lämpligt antal i blodet. Men mäter neutrofilmigrationen förmåga på kliniken är en utmanande uppgift, vilket är tidskrävande, kräver stor mängd blod, och expertkunskap. För att lösa dessa begränsningar, konstruerade vi en robust mikroflödesanalyser för neutrofil migration, vilket kräver en enda droppe av obehandlat blod, omständighetervents behovet av neutrofil separation, och är lätt att kvantifiera på ett enkelt mikroskop. I denna analys neutrofiler migrerar direkt från bloddroppe, genom små kanaler i riktning mot källan chemoattractant. För att förhindra att det granulära flöde av röda blodkroppar genom samma kanaler, genomförde vi mekaniska filter med rätt vinkel visar att selektivt blockera det för-av röda blodkroppar. Vi validerat analysen genom att jämföra neutrofilmigrationen från bloddroppar som samlats in från fingerprick och venöst blod. Vi jämförde även dessa helblod (WB) källor med neutrofil migration från prover av renade neutrofiler och fann konsekvent hastighet och riktning mellan de tre källorna. Denna mikroflödessystem plattform möjliggör studiet av mänskliga neutrofilmigrationen i kliniken och inställningen forskning för att förbättra vår förståelse av neutrofila funktioner i hälsa och sjukdom.
Introduction
Neutrofil handeln spelar en avgörande roll för att bestämma utvecklingen och upplösningen av många inflammatoriska tillstånd, däribland åderförkalkning 1, bakterieinfektion eller sepsis 2, och brännskador 3. För deras stora bidrag till hälso-och sjukdomstillstånd, är neutrofiler del av standarden blodanalys ofta som i kliniska och forskningslaboratorier. Men trots att en av de mest utbredda tester, värdet av neutrofiler vid diagnos av infektion och sepsis har ofta ifråga 4. Till exempel visade en studie av neutrofiler i brännskadepatienter som neutrofiler och neutrofil migration fungerar inte korrelerar; innebärande att neutrofilantal ensam inte är en exakt indikator på immunstatus 3. Även svårare att mäta, har neutrofila funktionell kompetens föreslagits som mer värdefull i ett brett spektrum av förhållanden.
t "> Viktigt många av neutrofila defekter är övergående och inte utlöses av permanenta genetiska defekter, en distinktion som har förbisetts i kliniken tills nyligen. I samband med brännskador, kan neutrofilmigration övervakas under en patients behandling som en indikator på inflammatorisk status eller infektion 3. Traditionella migrationsanalyser som för närvarande används i laboratoriet (Boyden kammare, Dunn kammare, mikropipett analys) kan inte översättas till en klinisk miljö eftersom de kräver stora mängder blod och besvärliga tidsödande neutrofilt isoleringstekniker (Tabell 1). Dessa analyser kan inte heller användas för att övervaka gående förändringar i neutrofil kemotaxi i små laboratoriedjur, såsom möss, eftersom volymen av blod som krävs för neutrofil isolering möjliggör endast ett prov och ofta till och med kräver sammanslagning av blod från flera djur för en enda analys. Exempelvis en studie med multiple villkor och behandlingar under flera tidpunkter skulle kunna kräva tusentals möss med dagens kemotaxi analyser. Detta begränsar den grundläggande biologisk forskning som kan göras för att förstå den komplexa dynamiken i immunförsvaret i samband med skada, infektion eller bränna ofta studerat i musmodeller 5.För att tillgodose behovet av en neutrofil funktionell analys som är snabba, robusta, samtidigt som den kräver minimal blodvolym, har vi utvecklat en mikrofluidanordning som mäter neutrofil kemotaxi direkt från en liten droppe helblod. Det är känt att många faktorer i helblod, däribland serum 6 och trombocyter 7, påverkar neutrofil funktion. Det är därför fördelaktigt att helblodet microfluidic assay minimerar provbearbetning för att bibehålla mikromiljön av neutrofil in vivo när man mäter variationer i kemotaxi med en in vitro analys 8. Detta tillvägagångssättreducerar tiden från blodsamling till neutrofil migration assays från timmar med användning av traditionella tekniker, för att bara några minuter (tabell 1). Hela blodmikroflödessystem plattform ger en stabil linjär chemoattractant gradient för längden av experimentet, har inga rörliga delar, och inte kräver en extern tryckkälla (dvs sprutpump). Den viktigaste funktionen i utformningen av helblod mikroflödessystem enhet är införlivandet av en röda blodkroppar (RBC) filtrerings kam som mekaniskt filtrerar röda blodkropparna från att komma in i migrationskanal på enheten. Rätt varv av denna filtrerings kam förebygga behovet av storleksuteslutande filtrering, vilket sannolikt skulle vara igensatt av de röda blodkropparna och därmed blockera chemoattractant gradient från att nå de aktivt flyttande neutrofiler i WB. Införlivandet av helblod mikroflödessystem enhet i en 12 eller 24-brunnar underlättar screening av multipla mediatorer för människa eller mus neutrofil kemotaxi simultaneously.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta arbete har vi utvecklat en mikroflödessystem plattform för att mäta neutrofil kemotaxi från en droppe blod (2 pl). Den on-chip mekanisk filtrering av röda blodkroppar från att aktivt migrera neutrofiler kringgår behovet av krångliga cellseparationsmetoder såsom densitetsgradienter 10, positiv selektion 11 eller negativt urval 12, som är benägna att införa artefakter genom att aktivera neutrofiler. Den mekaniska filtrering av RBC skiljer vår teknologi från andra mikr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Stöd från National Institutes of Health (beviljar GM092804, DE019938) och Shriners Burns Hospital.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Device Fabrication | |||
| SU8 | Microchem | Y131273 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 1.1 lb. Kit | |
| Standard glass slides | Fisher Scientific | 125495 | 1 X 3 inches |
| Glass-bottom plate | MatTek | P12G-1.5-14-F | |
| Harris Uni-Core, Tip Diameter 5.0mm | Ted Pella, Inc. | 15081 | |
| Harris Uni-Core, Tip Diameter 1.5 mm | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Microfluidic Assay Preparation and Analysis | |||
| Gel-loading pipet tip | Fisher Scientific | 02-707-139 | |
| Syringe | Fisher Scientfic | 309602 | |
| Blunt tip needle, 30g ½ in. | Brico Medical Supply | BN3005 | |
| Vacutainer, Heparin | Becton Dickinson | ||
| HBSS | Sigma-Aldrich | ||
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A5843-5G | 0.2% final concentration in HBSS |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895-1MG | |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506-10MG | |
| SurgiLance safety lancet, 2.2mm depth, 22 gauge | SLN240 | ||
| Hoescht stain | Life Technologies | H3570 | |
| Positive Control | |||
| HetaSep | STEMCELL Technologies Inc. | 7906 | |
| EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit | STEMCELL Technologies Inc. | 19257 | |
| Equipment | |||
| Plasma Asher | March Instruments | P-250 | |
| Lindberg/Blue M Oven | Thermo Scientific | 13-258-30C | |
| Stainless Steel Precision Tweezers | Techni Tool | 758TW458 | |
| Bel-Art Scienceware Chemical-Resistant Vacuum Desiccator | Fisher Scientific | 08-594-15A | |
| Dataplate Digital Hot Plate | Alpha Multiservices | PMC 720 | |
| Nikon TiE inverted microscope | Nikon – Micro Video Instruments Inc. | MEA53100 | |
| CFI Plan Fluor DL 10x na 15.2wd Objective | Nikon – Micro Video Instruments Inc. | MRH20101 | |
| Lumen 200 with 2 Meter Light Guide for Nikon | Nikon – Micro Video Instruments Inc. | 500-L200NI2 | |
| DAPI/Hoechst/AMCA Narrow Band 32mm Exciters – 25mm Emitters | Chroma – Micro Video Instruments Inc. | 31013v2 | |
| Retiga R 2000 cooled CCD Camera 1600×1200 pixels | Qimaging – Micro Video Instruments Inc. | RET-2000R-F-M-12-C |
Riferimenti
- Hansson, G. K., Robertson, A. K., Soderberg-Naucler, C. Inflammation and atherosclerosis. Annual review of pathology. 1, 297-329 (2006).
- Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nature medicine. 17, 1381-1390 (2011).
- Butler, K. L., et al. Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices. PloS one. 5, (2010).
- Lavrentieva, A., et al. Inflammatory markers in patients with severe burn injury. What is the best indicator of sepsis. Burns : journal of the International Society for Burn Injuries. 33, 189-194 (2007).
- De Filippo, K., et al. Mast cell and macrophage chemokines CXCL1/CXCL2 control the early stage of neutrophil recruitment during tissue inflammation. Blood. 121, 4930-4937 (2013).
- Mankovich, A. R., Lee, C. Y., Heinrich, V. Differential effects of serum heat treatment on chemotaxis and phagocytosis by human neutrophils. PloS one. 8, (2013).
- Palabrica, T., et al. Leukocyte accumulation promoting fibrin deposition is mediated in vivo by P-selectin on adherent platelets. Nature. 359, 848-851 (1992).
- Sackmann, E. K., et al. Microfluidic kit-on-a-lid: a versatile platform for neutrophil chemotaxis assays. Blood. 120, (2012).
- Jones, C. N., et al. Microfluidic chambers for monitoring leukocyte trafficking and humanized nano-proresolving medicines interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 20560-20565 (2012).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods Mol Biol. 412, 15-20 (2007).
- Lyons, P. A., et al. Microarray analysis of human leucocyte subsets: the advantages of positive selection and rapid purification. BMC genomics. 8, (2007).
- Hasenberg, M., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PloS one. 6, (2011).
- Agrawal, N., Toner, M., Irimia, D. Neutrophil migration assay from a drop of blood. Lab on a chip. 8, 2054-2061 (2008).
- Hoang, A. N., et al. Measuring neutrophil speed and directionality during chemotaxis, directly from a droplet of whole blood. Technology. , 1-9 (2013).
- Kurihara, T., et al. Resolvin D2 restores neutrophil directionality and improves survival after burns. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. , (2013).
- Buffone, V., Meakins, J. L., Christou, N. V. Neutrophil function in surgical patients. Relationship to adequate bacterial defenses. Arch Surg. 119, 39-43 (1984).
- Malawista, S. E., de Boisfleury Chevance, A., van Damme, J., Serhan, C. N. Tonic inhibition of chemotaxis in human plasma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 17949-17954 (2008).
