Criblage à haut débit pour à large spectre inhibiteurs chimiques de l'ARN virus

Summary

Les essais in vitro pour mesurer la réplication du virus a été grandement améliorée par la mise au point de virus à ARN recombinants exprimant la luciférase ou d'autres enzymes capables de bioluminescence. Ici, nous détaillons un pipeline de criblage à haut débit qui combine ces souches recombinantes de la rougeole et les virus de chikungunya à isoler antiviraux à large spectre de bibliothèques chimiques.

Abstract

virus à ARN sont responsables de maladies humaines majeures telles que la grippe, la bronchite, la dengue, l'hépatite C ou la rougeole. Ils représentent aussi une menace émergente en raison de l'augmentation des échanges à travers le monde et les populations humaines pénétrant écosystèmes de plus en plus naturelles. Un bon exemple d'une telle situation émergente est épidémies de virus du chikungunya de 2005-2006 dans l'océan Indien. Les progrès récents dans notre compréhension des voies cellulaires contrôlant la réplication virale suggèrent que des composés ciblant les fonctions de la cellule hôte, plutôt que le virus lui-même, pourraient inhiber un large panel de virus à ARN. Certains composés antiviraux à large spectre ont été identifiés avec accueil tests et ciblées. Toutefois, la mesure de l'inhibition de la réplication virale dans des cultures de cellules en utilisant la réduction de l'effet cytopathogène comme une visualisation représente encore une stratégie de dépistage primordiale. Ces écrans fonctionnels ont été grandement améliorées par le développement des virus recombinants exprimant journaliste enzymes capable de bioluminescence tel que la luciférase. Dans le présent rapport, nous détaillons un pipeline de criblage à haut débit, qui combine recombinant de la rougeole et les virus de chikungunya avec des tests de viabilité cellulaire, pour identifier des composés avec un profil antivirale à large spectre.

Introduction

virus à ARN sont responsables d'une grande variété d'infections humaines, et avoir un impact énorme sur les populations à travers le monde à la fois en termes de santé publique et de coût économique. Vaccins efficaces ont été mis au point contre plusieurs virus à ARN humain, et sont largement utilisés comme traitements prophylactiques. Cependant, il ya encore un manque crucial de médicaments thérapeutiques contre les infections de virus à ARN. En effet, les vaccins efficaces ne sont pas disponibles par rapport aux principales agents pathogènes humains tels que le virus de la dengue, virus de l'hépatite C ou le virus respiratoire syncytial humain (hRSV). En outre, des virus à ARN sont responsables de la majorité des maladies émergentes, qui ont augmenté en fréquence en raison des échanges mondiaux et l'impact humain sur les systèmes écologiques. Contre cette menace que représentent les virus à ARN, notre arsenal thérapeutique est très limitée et relativement inefficace ^1-3. Les traitements actuels sont essentiellement basés sur le type recombinant des interférons (IFN-α / β) pour stimuler l'immunité innée,ou l'administration de la ribavirine. Bien que le mode d'action de cette ribonucléoside analogique est controversée et s'appuie sur divers mécanismes probablement, l'inhibition de l'IMPDH cellulaire (inosine monophosphate déshydrogénase), qui épuise les pools intracellulaires de GTP, ⁴ est évidemment essentiel. La ribavirine, en combinaison avec PEG-IFN-α, est le principal traitement contre le virus de l'hépatite C. Cependant, les traitements IFN-α / β et ribavirine sont relativement pauvres efficacité in vivo contre la plupart des virus à ARN comme ils efficacement émoussé IFN-α / β de signalisation à travers l'expression de facteurs de virulence ⁵ et échappent souvent à la ribavirine ^3. Ceci ajouté au fait que le traitement de la ribavirine soulève des questions de toxicité importants, mais il a récemment été approuvé contre la maladie de hRSV sévère avec avantages controversés ^6. Plus récemment, certains traitements spécifiques du virus ont été commercialisés, en particulier contre le virus de la grippe avec le développement odes inhibiteurs de la neuraminidase f ^3. Cependant, la grande diversité et l'émergence permanente de virus à ARN empêche le développement de traitements spécifiques contre chacun d'eux dans un avenir relativement proche. Au total, ce insiste sur la nécessité de stratégies efficaces pour identifier et développer des molécules antivirales puissantes dans un proche avenir.

Il est trivial de dire que un inhibiteur à large spectre actif contre un large panel de virus à ARN permettrait de résoudre ce problème. Même si une telle molécule est toujours le rêve d'un virologue, notre meilleure compréhension des mécanismes de défense cellulaire et le système immunitaire inné suggèrent que des possibilités existent ^7,8. Plusieurs laboratoires académiques et industriels cherchent maintenant des molécules qui stimulent des aspects spécifiques des mécanismes de défense cellulaire ou des voies métaboliques à émousser la réplication virale. Bien que ces composés seront probablement montrer des effets secondaires importants, les traitements contre les infections virales aiguës seront administrered pour un temps relativement court, ce qui les rend acceptable malgré une certaine toxicité potentielle sur le long terme. Diverses stratégies ont été développées pour identifier ces large spectre des molécules antivirales. Certains programmes de recherche visent à trouver des molécules qui ciblent les voies spécifiques de la défense ou métaboliques. Cela comprend, par exemple, récepteurs de reconnaissance de l'agent pathogène à susciter l'expression des gènes antiviraux ⁹ et activer des facteurs antiviraux tels que RNaseL ^10, les machines de autophagy pour promouvoir la dégradation des virus ^11, à la synthèse de nucléoside parcours d'accompagnement ^12,13, ou cascades apoptotiques pour précipiter la mort de cellules infectées par des virus ^14. D'autres groupes ont développé des écrans phénotypiques qui ne sont pas fondées, cibler ^13,15-17. Dans ce cas, des molécules antivirales sont simplement identifiés par leur capacité à bloquer la replication virale dans un système cellulaire donné. L'hypothèse générale est que un composé inhibant 2-3 virus à ARN indépendants aurait un profil adapté pour un large spectrum molécule antivirale. Le mode d'action des composés de vie choisis avec une telle approche empirique n'est déterminé dans un second temps et finalement, peut conduire à l'identification de cibles cellulaires nouvelles d'antiviraux. Fait intéressant, une analyse rétrospective des nouveaux médicaments approuvés par la US Food and Drug Administration entre 1999 et 2008 a montré que, en général, ces projections phénotypiques ont tendance à mieux performer que les approches fondées sur des objectifs à découvrir des médicaments à petites molécules de première en classe ¹⁸ .

La réplication virale dans les tests cellulaires à haut débit est généralement déterminée à partir de virus effets cytopathiques. Les cellules sont infectées et cultivées dans des 96 – ou des plaques à 384 puits en présence des composés testés. Après quelques jours, les couches cellulaires sont fixées et colorées avec des colorants tels que le violet de cristal. Enfin, l'absorbance est mesurée avec un lecteur de plaques et de composés inhibiteurs de la replication virale sont identifiés par leur capacité à conserver des couches cellulaires from induite par le virus effet cytopathique. Alternativement, un effet cytopathogène viral-médiation sont évalués en utilisant des analyses de viabilité standard telles que la réduction MTS. De tels dosages sont très maniable et rentable, mais souffrent de trois limites majeures. D'abord, ils exigent une combinaison virus-cellule, la réplication virale est cytopathique en seulement quelques jours, mais ce n'est pas toujours possible, appelant ainsi à ¹⁹ autres approches. Deuxièmement, ils sont mal quantitative car elles sont fondées sur une mesure indirecte de la réplication virale. Enfin, les composés toxiques peuvent être marqués comme résultats positifs, et doivent donc être éliminées avec un écran de mesure contre la viabilité cellulaire. Pour surmonter certains de ces obstacles, des virus ou des réplicons recombinants ont été conçus par génétique inverse pour exprimer des protéines rapporteurs, tels que la EGFP ou la luciférase, à partir d'une unité de transcription supplémentaire ou dans le cadre avec des gènes de protéines virales (quelques exemples ^20-23). Lorsque ces virus se répliquent, journaliste proteins sont produites conjointement avec des protéines virales eux-mêmes. Ceci permet d'obtenir un dosage très quantitative pour mesurer la replication virale et à évaluer l'activité inhibitrice des molécules candidates. Cela est particulièrement vrai pour les virus recombinants exprimant la luciférase (ou d'autres enzymes capables de bioluminescence) puisque ce système rapporteur présente une large gamme dynamique avec une haute sensibilité et pratiquement pas de fond. En outre, il n'y a pas de source de lumière d'excitation, empêchant ainsi l'interférence avec le composé ²⁴ fluorescence.

Ici, nous détaillons un protocole haut débit pour cribler des bibliothèques chimiques pour les inhibiteurs à large spectre de virus à ARN. Les composés sont testés en premier sur les cellules humaines infectées par un virus recombinant de la rougeole (MV) exprimant la luciférase de luciole ²⁵ (rMV2/Luc, figure 1, l'écran primaire). MV appartient à Mononegavirales ordre, et est souvent considéré comme un membre prototypique de virus à ARN négatifes. En tant que tel, génome MV est utilisée comme matrice par la polymerase virale de synthétiser des molécules d'ARNm codant pour les protéines virales. Dans la souche MV recombinant appelé rMV2/Luc, expression de la luciférase est exprimée à partir d'une unité de transcription additionnelle insérée entre les gènes P et M (figure 2A). En parallèle, les composés sont testés pour leur toxicité sur des cellules humaines en utilisant un réactif à base de luciférase-commercial qui évalue, par quantification de l'ATP, le nombre de cellules métaboliquement actives en culture (figure 1, l'écran primaire). Bibliothèques chimiques entiers peuvent être facilement sélectionnés avec ces deux tests afin de sélectionner des composés qui ne sont pas toxiques et qui bloquent efficacement la réplication MV. Ensuite, les coups sont à nouveau testés pour l'inhibition dose-réponse de la réplication MV, l'absence de toxicité ainsi que pour leur capacité à nuire à virus chikungunya (CHIKV) réplication (figure 1, l'écran secondaire). CHIKV est un membre de la famille des Togaviridae, et son génome est apositive molécule d'ARN simple brin. En tant que tel, il est complètement étranger à la rougeole et des composés inhibant la fois MV et CHIKV une grande chance pour inhiber un large panel de virus à ARN. Les protéines non structurales CHIKV sont directement traduits à partir du génome viral, alors que les protéines structurales sont codées par transcription et traduction d'une molécule d'ARNm sub-génomique. Notre test in vitro de la réplication de CHIKV est basé sur une souche recombinante appelée CHIKV / Ren, qui exprime la luciférase de Renilla enzyme comme une partie séparée par clivage de la polyprotéine non structurale par le biais d'une insertion du gène rapporteur entre nsP3 et séquences nsP4 ²⁶ (figure 2B). La mesure de l'activité de la luciférase de Renilla permet le contrôle de la réplication virale, au stade précoce du cycle de vie CHIKV.

Ce protocole à haut débit a été utilisé pour identifier rapidement des composés avec un profil adapté pour antiviraux à large spectre dans une bibliothèque commerciale de 10 000 molecdules enrichie de la diversité chimique. Les composés ont été essentiellement suivent la règle de Lipinski de cinq ans, avec des poids moléculaires allant de 250 à 600 daltons, et valeurs du log D en dessous de 5. Plupart de ces molécules sont de nouvelles entités chimiques ne sont pas disponibles dans d'autres bibliothèques commerciales.

Protocol

1. Préparation de 96 puits fille plaques avec les composés Déplacer plaques mères à 96 puits contenant 10 mM de solutions de composés chimiques dans le DMSO à partir de -20 ° C à la température ambiante. Diluer composés 5x dans le DMSO pour obtenir des plaques de dilution 96 puits intermédiaires à 2 mM. La dilution est réalisée par pipetage de 5 ul dans 20 ul de DMSO et de mélange. 1 ul de plaques de dilution dans les puits sec de blanc, de culture de tissu à code à barres des plaq…

Representative Results

Ce pipeline de dépistage repose d'abord sur la sélection de composés qui inhibent la réplication MV et ne présentent pas de toxicité cellulaire significative (figure 1, l'écran principal). Il tire parti des dosages à base de luciférase pour déterminer la toxicité cellulaire et l'inhibition de la réplication virale. Toutes les étapes de pipetage et d'acquisition des données peut être effectué dans un cadre de haut-débit avec une plate-forme robotique. <p class="jove_c…

Discussion

Le pipeline de criblage décrit ici vise à sélectionner des composés avec un profil adapté comme inhibiteurs à large spectre de virus à ARN. Quand une bibliothèque de 10 000 composés a été criblée avec ce protocole et les critères de filtrage ci-dessus ont été appliquées, à savoir l'inhibition de la réplication MV supérieur à 75%, 40 composés (0,4%) a reçu positif. En outre, environ la moitié d'entre eux ont montré une toxicité sur dans le test de la viabilité en fonction de la …

Materials

Freedom EVO platform	TECAN		Robotic platform
96-Well Polystyrene Cell Culture Microplates, White	Greiner Bio One	655083
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay	Promega	G7570	Luciferase-based viability assay
Bright-Glo Luciferase Assay System	Promega	E2610	Reagent containing firefly luciferase substrate
Renilla-Glo Luciferase Assay System	Promega	E2710	Reagent containing Renilla luciferase substrate
Britelite plus Reporter Gene Assay System	Perkin-Elmer	6016761	Reagent containing firefly luciferase substrate. Can be used as an alternative to Brigh-Glo reagent to determine luciferase activity