Triagem de alta capacidade para amplo espectro químico Inibidores de Vírus RNA

Summary

Os ensaios in vitro para medir a replicação do vírus tem sido melhorada pelo desenvolvimento de vírus de RNA recombinantes que expressam luciferase ou outras enzimas capazes de bioluminescência. Aqui detalhamos uma triagem gasoduto de alto rendimento, que combina essas linhagens recombinantes de sarampo e vírus chikungunya para isolar os antivirais de amplo espectro de bibliotecas químicas.

Abstract

Vírus de RNA são responsáveis ​​por importantes doenças humanas, tais como a gripe, bronquite, dengue, hepatite C ou sarampo. Eles também representam uma ameaça emergente devido ao aumento das trocas em todo o mundo e as populações humanas penetrantes ecossistemas mais e mais naturais. Um bom exemplo desse tipo de situação emergente é epidemias de vírus chikungunya de 2005-2006, no Oceano Índico. Avanços recentes em nossa compreensão de caminhos celulares que controlam a replicação viral sugerem que os compostos que visam funções da célula hospedeira, em vez de o próprio vírus, poderia inibir um grande painel de vírus RNA. Alguns compostos anti-virais de amplo espectro têm sido identificados com ensaios orientados-alvo do hospedeiro. No entanto, a medição da inibição da replicação do vírus em culturas de células utilizando a redução de efeitos citopáticos como uma leitura ainda representa uma estratégia de rastreio primordial. Esses rastreios funcionais foram significativamente melhoradas pelo desenvolvimento de vírus recombinantes que expressam as enzimas repórter cazes de bioluminescência, tais como a luciferase. No presente relatório, detalhamos um gasoduto high-throughput screening, que combina o sarampo recombinante e vírus chikungunya com ensaios de viabilidade celular, para identificar compostos com um perfil antiviral de amplo espectro.

Introduction

Vírus de RNA são responsáveis ​​por uma grande variedade de infecções humanas, e têm um enorme impacto sobre as populações de todo o mundo, tanto em termos de saúde pública e de custo econômico. Vacinas eficazes têm sido desenvolvidos contra diversos vírus de ARN humano, e são amplamente utilizados como tratamentos profiláticos. No entanto, ainda existe uma falta crítica de medicamentos terapêuticos contra infecções por vírus RNA. Na verdade, as vacinas não estão disponíveis eficientes contra as principais patógenos humanos, tais como o vírus da dengue, vírus da hepatite C ou vírus respiratório sincicial humano (HRSV). Além disso, os vírus de RNA são responsáveis ​​pela maioria das doenças emergentes, que aumentaram em freqüência por causa de trocas globais e impacto humano sobre sistemas ecológicos. Contra esta ameaça que representam os vírus de RNA, nosso arsenal terapêutico é extremamente limitado e relativamente ineficiente ^1-3. As terapias atuais são, essencialmente, com base no tipo recombinante interferons I (IFN-α / β) para estimular a imunidade inata,ou a administração de ribavirina. Embora o modo de ação deste analógico ribonucleosido é controverso e, provavelmente, depende de vários mecanismos, a inibição da IMFDH celular (inosina monofosfato desidrogenase), que esgota intracelulares piscinas GTP, é claramente essencial ^4. Ribavirina, em combinação com IFN-α peguilado, é o principal tratamento contra o vírus da hepatite C. No entanto, os tratamentos de IFN-α / β e ribavirina são de relativamente fraca eficácia in vivo contra a maioria dos vírus de ARN em que a sinalização eficiente romba IFN-α / β através da expressão da virulência ⁵ e frequentemente escapar ribavirina ^3. Isso, somado ao fato de que a ribavirina está levantando questões importantes de toxicidade, embora tenha sido aprovado recentemente contra a doença hRSV grave com benefícios controversos ^6. Mais recentemente, alguns tratamentos específicos do vírus têm sido comercializados, em particular contra o vírus influenza, com o desenvolvimento of inibidores da neuraminidase ^3. No entanto, a grande diversidade e emergência permanente de vírus RNA impede o desenvolvimento de tratamentos específicos contra cada um deles em um futuro relativamente próximo. Ao todo, este sublinha a necessidade de estratégias eficientes para identificar e desenvolver moléculas antivirais potentes em um futuro próximo.

É trivial para dizer que um inibidor de largo espectro activo contra um grande painel de vírus de ARN resolveria este problema. Embora tal molécula ainda é o sonho de um virologista, a nossa melhor compreensão dos mecanismos de defesa celular e sistema imune inato sugerem que algumas possibilidades existem ^7,8. Vários laboratórios acadêmicos e industriais estão agora a procurar moléculas que estimulam facetas específicas de mecanismos de defesa celular ou vias metabólicas para diminuir a replicação viral. Embora tais compostos provavelmente mostram efeitos colaterais significativos, tratamentos contra infecções virais agudas serão administrared por um tempo relativamente curto, tornando-as aceitáveis, apesar de alguma toxicidade potencial no longo prazo. Várias estratégias têm sido desenvolvidos para identificar estas moléculas antivirais de largo espectro. Alguns programas de pesquisa visam encontrar moléculas que têm como alvo as vias de defesa ou metabólicas específicas. Isso inclui, por exemplo, receptores de reconhecimento de patógenos, para esclarecer a expressão do gene antiviral ⁹ e ativam fatores antivirais como RNaseL ^10, máquinas autofagia para promover a degradação do vírus ^11, a síntese de nucleosídeos vias ^12,13, ou cascatas apoptóticos para precipitar a morte de células infectadas por vírus ^14. Outros grupos têm desenvolvido telas fenotípicos que não são baseadas em alvo ^13,15-17. Nesse caso, as moléculas antivirais são simplesmente identificados pela sua capacidade para bloquear a replicação do vírus em um determinado sistema celular. A suposição é de que em geral um composto inibidor de 2-3 vírus RNA não relacionadas que têm um perfil apropriado para um amplo spectrum molécula antiviral. O modo de acção dos compostos seleccionados de golpes com uma tal abordagem empírica é determinado apenas em um segundo tempo e, eventualmente, pode levar à identificação de novos alvos celulares para antivirais. Curiosamente, uma análise retrospectiva de novas drogas aprovadas pelo os EUA Food and Drug Administration, entre 1999 e 2008 mostrou que, em geral, esses exames fenotípicas tendem a ter melhor do que as abordagens por objectivo realizar a descobrir primeiro-in-class drogas de pequenas moléculas ¹⁸ .

A replicação viral em ensaios baseados em células de alto rendimento geralmente é determinada a partir de efeitos citopáticos do vírus. As células são infectadas e cultivadas em 96 – ou placas de 384 poços na presença dos compostos testados. Depois de alguns dias, as camadas celulares são fixadas e coradas com corantes, tais como violeta de cristal. Finalmente, a absorvência é determinada com um leitor de placas e os compostos que inibem a replicação viral são identificados pela sua capacidade para preservar as camadas celulares from efeito citopático induzido pelo vírus. Alternativamente, os efeitos citopáticos mediados por vírus são avaliados utilizando ensaios de viabilidade de padrão, tais como a redução de MTS. Tais ensaios são altamente tratável e de baixo custo, mas sofrem de três grandes limitações. Primeiro, eles exigem uma combinação vírus-célula, onde a replicação viral é citopático em apenas alguns dias, mas nem sempre isso é possível, chamando, assim, para abordagens alternativas ^19. Em segundo lugar, eles são mal quantitativa, uma vez que são baseados em uma medida indireta da replicação viral. Finalmente, os compostos tóxicos podem ser classificados como resultados positivos, e, portanto, deve ser eliminado, com um ecrã de contador que mede a viabilidade celular. Para ultrapassar algumas destas dificuldades, os vírus recombinantes, ou replicões foram projectadas por genética reversa para expressar proteínas repórter, tal como luciferase ou EGFP, a partir de uma unidade de transcrição adicional ou em grelha com genes de proteínas virais (alguns exemplos são ^20-23). Quando estes vírus se replicar, pr repórteroteins são produzidos em conjunto com as proteínas virais próprios. Isto proporciona um ensaio muito quantitativa para medir a replicação viral e avaliar a actividade inibidora de moléculas candidatas. Isto é particularmente verdadeiro para os vírus recombinantes que exprimem a luciferase (ou outras enzimas capazes de bioluminescência) uma vez que este sistema repórter apresenta uma vasta gama dinâmica, com uma elevada sensibilidade e praticamente sem fundo. Além disso, não há uma fonte de luz de excitação, evitando assim a interferência com fluorescência composto ^24.

Aqui, detalhes de um protocolo de alto rendimento para a tela bibliotecas químicas para inibidores de amplo espectro de vírus RNA. Os compostos são testados em células de seres humanos infectados com um vírus de sarampo recombinante (MV) que expressam a luciferase do pirilampo ²⁵ (rMV2/Luc, Figura 1, a tela de primário). MV pertence Mononegavirales ordem, e é muitas vezes considerado como um membro protótipo de vírus RNA de cadeia negativaes. Como tal, MV genoma é utilizada como um modelo de polimerase viral para sintetizar moléculas de mRNA que codificam para as proteínas virais. Na estirpe recombinante denominado MV rMV2/Luc, a expressão da luciferase é expressa a partir de uma unidade de transcrição adicionais inseridos entre os genes P e M (Figura 2A). Em paralelo, os compostos são testados quanto à sua toxicidade em células humanas utilizando um reagente à base de luciferase comercial que avalia, por quantificação de ATP, o número de células metabolicamente activas na cultura (Figura 1, o ecrã primário). Bibliotecas químicas inteiras podem ser facilmente rastreados com estes dois ensaios, a fim de seleccionar os compostos que não são tóxicos e bloqueiam eficazmente a replicação MV. Em seguida, os hits são testados para a inibição de dose-resposta de replicação MV, a falta de toxicidade assim como quanto à sua capacidade para afectar o vírus Chikungunya (CHIKV) replicação (Figura 1, o ecrã secundário). CHIKV é um membro da família Togaviridae e seu genoma é apmolécula de RNA de fita simples ositive. Como tal, é completamente alheios ao sarampo e compostos que inibem tanto MV e CHIKV tem uma chance grande de inibir um grande painel de vírus RNA. Proteínas não estruturais são CHIKV directamente traduzido a partir do genoma viral, enquanto que as proteínas estruturais são codificadas através de transcrição e tradução de uma molécula de ARNm subgenómico. O nosso ensaio de replicação in vitro para CHIKV baseia-se uma estirpe recombinante denominado CHIKV / Ren, que expressa a enzima luciferase de Renilla como uma parte clivada da poliproteína não estrutural por meio de uma inserção do gene repórter entre NSP3 e NSP4 sequências de ²⁶ (Figura 2B). A medida da atividade da luciferase Renilla permite o monitoramento da replicação viral na fase inicial do ciclo de vida CHIKV.

Este protocolo de alto rendimento foi usada para identificar rapidamente os compostos com um perfil adequado para os antivirais de largo espectro de uma biblioteca comercial de 10.000 Molecules enriquecido pela diversidade química. Os compostos foram essencialmente seguinte regra de cinco de Lipinski, com pesos moleculares variando 250-600 daltons, e registrar valores de D abaixo de 5. Maioria dessas moléculas eram novas entidades químicas não disponíveis em outras bibliotecas comerciais.

Protocol

1. Preparação de placas de 96 poços com filha Compostos Mover placas mãe de 96 cavidades que contêm soluções-mãe 10 mM de compostos químicos em DMSO a partir de -20 ° C até à temperatura ambiente. Diluir 5x compostos em DMSO para se obter placas de intermediários de diluição de 96 poços a 2 mM. A diluição é obtida por pipetagem de 5 ul em 20 ul de DMSO e a mistura. Pipete 1 mL de diluição em placas de poços de branco seco, de cultura de tecidos de código de barras placas de 96…

Representative Results

Este gasoduto triagem depende em primeiro lugar na seleção de compostos que inibem a replicação do MV e não mostram qualquer toxicidade celular significativa (Figura 1, a tela principal). Aproveita-se os ensaios baseados em luciferase para determinar a toxicidade celular e a inibição da replicação viral. Todos os passos de pipetagem e de aquisição de dados pode ser realizada em um ambiente de alto rendimento com uma plataforma robótica. A toxicidade celular dos c…

Discussion

O gasoduto triagem descrito aqui tem como objectivo seleccionar compostos com um perfil adequado como inibidores de amplo espectro de vírus RNA. Quando uma biblioteca de 10.000 compostos foi exibido com este protocolo e critérios de filtragem acima referidos foram aplicados, ou seja, a inibição da replicação MV superior a 75%, 40 compostos (0,4%) resultados positivos. Além disso, cerca de metade deles mostraram alguma toxicidade no ensaio de viabilidade com base em luciferase, e foram desconsiderados por…

Materials

Freedom EVO platform	TECAN		Robotic platform
96-Well Polystyrene Cell Culture Microplates, White	Greiner Bio One	655083
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay	Promega	G7570	Luciferase-based viability assay
Bright-Glo Luciferase Assay System	Promega	E2610	Reagent containing firefly luciferase substrate
Renilla-Glo Luciferase Assay System	Promega	E2710	Reagent containing Renilla luciferase substrate
Britelite plus Reporter Gene Assay System	Perkin-Elmer	6016761	Reagent containing firefly luciferase substrate. Can be used as an alternative to Brigh-Glo reagent to determine luciferase activity