एक माउस, दो संस्कृतियों: अलगाव और वयस्क तंत्रिका की संस्कृति व्यक्तिगत चूहों के दो तंत्रिकाजन्य क्षेत्रों से स्टेम सेल
Summary
यहाँ हम subventricular क्षेत्र और व्यक्तिगत वयस्क चूहों की दांतेदार गाइरस से, पक्षपाती monolayers या neurospheres रूप में या तो, तंत्रिका अग्रदूत सेल संस्कृतियों के एक साथ पीढ़ी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन.
Abstract
neurosphere परख और पक्षपाती monolayer संस्कृति प्रणाली संभावित विट्रो में वयस्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के (प्रसार या भेदभाव) निर्धारित करने के लिए मूल्यवान उपकरण हैं. ये assays तंत्रिका अग्रदूत सेल प्रसार और भेदभाव पर exogenous कारकों के प्रभाव को निर्धारित करने और निरंतर अंश से अधिक assayed किया जा सकता है कि तंत्रिका अग्रदूत सेल लाइनों उत्पन्न करने के लिए आनुवंशिक रूप से अलग या विभिन्न इलाज जानवरों से अलग कोशिकाओं के अग्रदूत संभावित तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. neurosphere परख पारंपरिक रूप से मुख्य रूप से वे प्राथमिक ऊतक से अलग और मस्तिष्क के ऊतकों में अग्रदूत सेल नंबर की एक त्वरित अनुमान देने का प्रमुख लाभ दिया जा सकता है, जिसके साथ निश्चित मार्कर की कमी के कारण, स्टेम सेल के बाद अस्थायी पहचान के लिए प्रयोग किया जाता है व्यक्तिगत जानवरों से निकाली गई. पक्षपाती monolayer संस्कृतियों, इसके विपरीत, पारंपरिक रूप से व्यक्ति पशुओं के बीच प्रसार की तुलना करने के लिए इस्तेमाल नहीं कर रहे हैंप्रत्येक संस्कृति आम तौर पर 5-8 के बीच जानवरों के संयुक्त ऊतक से शुरू की है. हालांकि, वे neurospheres के विपरीत, वे अग्रदूत साबित कोशिकाओं के एक ज्यादातर सजातीय जनसंख्या से मिलकर और एकल कक्षों में भेदभाव प्रक्रिया के बाद के लिए उपयोगी होते हैं कि प्रमुख लाभ है. यहाँ, हम पहली बार के लिए, व्यक्ति पशुओं से पक्षपाती संस्कृतियों, विस्तार से, neurosphere संस्कृतियों की पीढ़ी का वर्णन है और. इस subventricular क्षेत्र (SVZ) और इलाज या आनुवंशिक रूप से अलग माउस लाइनों की दांतेदार गाइरस (डीजी) दोनों में प्रसार और / या भेदभाव की क्षमता की बनती विश्लेषण, साथ ही पशु के उपयोग में एक महत्वपूर्ण कमी सहित कई महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है.
Introduction
neurosphere परख 1,2 और पक्षपाती monolayer संस्कृति 3,4, दोनों 1990 के दशक में विकसित की है, अभी भी इन विट्रो तंत्रिका स्टेम सेल assays में सोने के मानक रहते हैं. इन assays में, प्राथमिक ऊतक एक विशेष मस्तिष्क क्षेत्र से सूक्ष्म विच्छेदित है, मुक्त अस्थायी या तो कारक -2 (FGF2) बनाने के लिए एक एकल कक्ष निलंबन और mitogens epidermal वृद्धि कारक (EGF) और fibroblast वृद्धि की उपस्थिति में सुसंस्कृत में अलग समूहों (neurospheres) या पक्षपाती monolayers. दोनों प्रणालियों के फायदे और नुकसान और सावधानी से विचार करने के लिए एक नंबर एक या अन्य प्रणाली को चुना है पहले संबोधित करने की है कि प्रश्न करने के लिए दिया जाना चाहिए है.
Neurospheres अग्रदूत सेल संख्या और क्षमता में अंतर का एक सीधा पढ़ने के लिए बाहर की अनुमति. इसके अलावा, neurospheres भी अपने सामान्य बाहरी वातावरण से निकाल दिया जब कोशिकाओं के आंतरिक विनिर्देश अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण हैं. Extrinइस प्रकार से cues बस मध्यम विकास के लिए ब्याज की कारक जोड़ने और उत्पन्न neurospheres की संख्या और आकार बढ़ाता द्वारा अध्ययन किया जा सकता है. neurospheres की बड़ी खामी हालांकि, वे सतह 5 पर उन लोगों की तुलना में अधिक विभेदित किया जा रहा neurospheres (विशेष रूप से बड़े neurospheres) के केंद्र में कोशिकाओं के साथ, अपने स्वयं के आला कि फार्म है. Neurospheres स्टेम सेल, प्रतिबद्ध progenitors, और विभेदित कोशिकाओं और neurospheres भीतर सेल सेल बातचीत स्टेम कोशिकाओं के रखरखाव प्रतिक्रिया का मिश्रण होते हैं. Neurospheres सच स्टेम कोशिकाओं 6-8 की केवल एक छोटा सा संख्या में होते हैं यही कारण है.
पक्षपाती monolayer संस्कृतियों भी विवो प्रसार में मॉडल के लिए एक अच्छा इन विट्रो प्रणाली प्रदान करते हैं. कोशिकाओं को और अधिक अलग और सजातीय रहते हैं जिसमें पक्षपाती संस्कृतियों, neurosphere की विषम प्रकृति को खत्म कर सकते हैं. इन विकास परिस्थितियों अग्रदूत साबित कोशिकाओं rapi पैदा करनाdly और लगभग सभी कोशिकाओं को विभाजित और विशेषता तंत्रिका अग्रदूत मार्करों nestin, Sox2, और BLBP व्यक्त कर रहे हैं. neurosphere परख की तुलना में monolayer संस्कृति प्रणाली का बड़ा नुकसान व्यक्तिगत अग्रदूत व्युत्पन्न क्लोन और निगरानी की मात्रा निर्धारित करने में असमर्थ रहे हैं.
अलगाव रणनीतियों की उपज अक्सर गरीब किया गया है क्योंकि संस्कृतियों के दोनों प्रकार के लिए सबसे प्रोटोकॉल की एक खामी है, जानवरों की अपेक्षाकृत बड़ी संख्या का उपयोग करने के लिए आवश्यकता हो गया है. उसी समय, यह वयस्क neurogenesis के रूप में अच्छी तरह से व्यक्तिगत पूर्व vivo मॉडल के लिए की जरूरत है, जिसके परिणामस्वरूप मस्तिष्क 9 के वैयक्तिकरण के लिए योगदान देता है कि स्पष्ट हो गया है. इस रिपोर्ट में वर्णित के रूप में इन आवश्यकताओं "एक माउस, एक संस्कृति" प्रोटोकॉल से मुलाकात कर सकते हैं.
निम्न Visual प्रोटोकॉल SVZ और महानिदेशक व्यक्ति पशुओं के रूप में या तो पक्षपाती एम दोनों से तंत्रिका अग्रदूत संस्कृतियों के एक साथ पीढ़ी का वर्णनonolayers या neurospheres के रूप में. व्यक्तिगत जानवरों से संस्कृतियों की पीढ़ी को व्यक्तिगत रूप से पशुओं का इलाज या विभिन्न व्यक्तिगत ट्रांसजेनिक या जंगली प्रकार चूहों के बीच तुलना के लिए आवश्यक हैं जब विशेष रूप से उपयोगी है. इस प्रोटोकॉल में विस्तृत वयस्क चूहों से SVZ और महानिदेशक क्षेत्रों के एक साथ microdissection के लिए निर्देश, एक एकल कक्ष निलंबन में उनके हदबंदी, पक्षपाती monolayer संस्कृतियों या neurospheres और multipotentiality और दीर्घकालिक क्षमता का विश्लेषण रूप में या तो इन विट्रो संस्कृति, दो कार्डिनल शामिल एक हड्डी फाइड स्टेम सेल के गुण.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पत्र वयस्क माउस मस्तिष्क के दो प्रमुख तंत्रिकाजन्य क्षेत्रों से तंत्रिका अग्रदूत संस्कृतियों, के रूप में पक्षपाती monolayers और neurospheres दोनों, की दीक्षा के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है. इन में इन विट्रो संस्कृति प्रणालियों में से किसी का प्रयास करते समय ध्यान में रखा जाना चाहिए कि महत्वपूर्ण बिंदुओं में से एक नंबर रहे हैं. सबसे पहले, पृथक्करण विधि का चुनाव बहुत महत्वपूर्ण है और ऊतक निर्भर है. हमारे हाथ में, 0.05% trypsin EDTA SVZ ऊतक की हदबंदी के लिए बहुत प्रभावी है, और एक papain आधारित हदबंदी तकनीक का उपयोग कर जब से neurospheres के एक उच्च संख्या में परिणाम है. डीजी ऊतक की हदबंदी के लिए हालांकि, हम दृढ़ता से एक papain आधारित हदबंदी दृष्टिकोण की सिफारिश. सीधे डीजी ऊतक पर दो हदबंदी तरीकों की तुलना, हम व्यवहार्य कोशिकाओं के एक काफी कम उपज मनाया और trypsin का उपयोग करते समय लगभग कम neurospheres 10 गुना. हदबंदी में यह अंतर ऊतक compositio में अंतर के कारण हो सकता हैदोनों क्षेत्रों के बीच एन. डीजी की कॉम्पैक्ट ऊतक व्यापक neuropil से घिरा हुआ है और सेलुलर प्रक्रियाओं की व्यापक क्षति हदबंदी के दौरान हो सकता है.
नोट करने के लिए एक दूसरा महत्वपूर्ण बिंदु neurosphere परख एक दिया ऊतक के नमूने में मौजूद अग्रदूत साबित कोशिकाओं की संख्या के बारे में मात्रात्मक बयान करने के लिए उपयोगी हो सकता है, जबकि कुछ सावधानी, हालांकि, इन निरपेक्ष संख्या की व्याख्या में नियोजित किया जाना चाहिए, कि है. Neurospheres का फ्यूजन एक प्रमुख confounding कारक हो सकता है. कई अध्ययनों से न्यूरॉन्स अत्यधिक गतिशील हैं और यहां तक कि माना जाता है कि 'प्रतिरूप' शर्तों 7,19 क्या कर रहे हैं के तहत, फ्यूज कर सकते हैं कि पता चला है. परिणामस्वरूप neurosphere आवृत्ति मध्यम घटकों, विच्छेदन की प्रक्रिया और पृथक्करण की प्रक्रिया सहित कारकों पर निर्भर हो सकता है. यहां तक कि अनुभवी आकाओं के बीच माना जाता है कि समान नमूने से उत्पन्न neurospheres की संख्या में कुछ बदलाव (चित्रा 1 ए को देखने से स्पष्ट है.) अधिक उपयोगी, दिए गए दो नमूने (यानी नियंत्रण बनाम इलाज या जंगली प्रकार बनाम नाक आउट) बल्कि कुल का एक मात्रात्मक बयान से, एक ही प्रयोग के भीतर एक ही व्यक्ति द्वारा नियंत्रित के बीच अग्रदूत आवृत्ति के एक प्रत्यक्ष तुलना है अग्रदूत सेल नंबर.
यह इन दो संस्कृति प्रणालियों उत्पन्न सेल प्रकार की एकरूपता में मतभेद है कि नोट करना महत्वपूर्ण है एक विशेष रूप से प्रयोग के लिए सबसे अनुकूल है, दो संस्कृति तरीकों की जो जब फैसला. एक काफी सजातीय अग्रदूत सेल पूल (~ कोशिकाओं के 98% Sox2 +) कर रहे हैं जो बताते हैं पक्षपाती सेल संस्कृतियों, proliferating की तुलना में 20, neurospheres अधिक विषम हैं और होते हैं, साथ ही proliferating कोशिकाओं अग्रदूत, विभेदित न्यूरॉन्स, और astrocytes 21,22. यह neurospheres बड़े रूप में मार्ग के बीच विस्तारित अवधि के लिए सुसंस्कृत नहीं कर रहे हैं यह महत्वपूर्ण है कि यह अपने मूल में विभेदित सेल प्रकार मिल रहा है और अधिक होने की संभावना बन neurosphere.
हम पारंपरिक रूप से 5-8 के बीच चूहों के महानिदेशक ऊतक से पक्षपाती monolayer तंत्रिका अग्रदूत संस्कृतियों आरंभ. एक माउस के महानिदेशक या SVZ से पक्षपाती monolayer संस्कृतियों स्थापित करने का प्रयास करते हैं, इसलिए, अत्यंत सावधानी ऊतक के triturating से अधिक की वजह से अत्यधिक कोशिका मृत्यु से बचने के लिए ऊतक हदबंदी की प्रक्रिया के दौरान उठाए जाने की जरूरत है, या विस्तारित लेने विच्छेदन और अंतिम संवर्धन कदम के बीच समय की अवधि. इस प्रोटोकॉल, पहली बार के लिए, का वर्णन व्यक्ति पशुओं के SVZ और डीजी दोनों से पक्षपाती monolayer अग्रदूत संस्कृतियों की पीढ़ी. अग्रदूत प्रसार और भेदभाव की तुलना एक भी पशु आधार पर किए जाने की जरूरत है जब कई उदाहरण हैं. ये सीधे डीजी और बनती आँकड़ों का उपयोग कर व्यक्ति पशुओं के SVZ तुलना करने के लिए और व्यक्तिगत व्यवहार या शारीरिक डेटा 9 के साथ संस्कृति डेटा युग्मित करने की क्षमता शामिल है. एकल जानवर संस्कृतियों भी अलआनुवंशिक संघ अध्ययन के लिए उम्र से मिलान संस्कृति प्रति 5-8 दाताओं की एक पूल संभव नहीं है, जहां दुर्लभ ट्रांसजेनिक जानवर,, साथ ही अद्वितीय जानवरों (जैसे F2 पार या बाहर नस्ल के पशुओं) के कम उपयोग.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TLW एक मैरी क्यूरी इंटरनेशनल आने वाली फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया. यह काम भी बुनियादी संस्थागत धन से वित्तपोषित किया गया था, Bundesministerium Bildung और Forschung (BMBF) धन और आंशिक रूप से जी.के. को प्राथमिकता रिसर्च प्रोग्राम (SFB) 655 से समर्थन के साथ फर. लेखकों की देखभाल और सभी इस अध्ययन में प्रयुक्त जानवर और Odette लीटर, Susann Ruhwald, फैनी Boehme, और सेल संस्कृति और माइक्रोस्कोपी सहायता के लिए रिचर्ड Wetzel के रखरखाव के लिए ऐनी Karasinsky धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| CONSUMABLES | |||
| poly-D-lysine | Sigma | P7280-5MG | |
| laminin | Roche | 11243217001 | |
| glass pastuer pipettes | Volac | BS5732 | |
| DMEM:F12 (1:1) 1X | Life Technologies | 21331-020 | |
| Neural Basal Medium (1X) | Life Technologies | 21103-049 | |
| B27 supplements (50X) | Life Technologies | 17504-044 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-038 | |
| Heparain | Sigma | H3393 | |
| Penacillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| bFGF | PeproTech | 100-18B | |
| 0.05% trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | |
| DNaseI | Roche | 10104159001 | |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| Papain | Worthington | LS003120 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| HBSS (with Calcium & Magnesium) | Life Technologies | 14025-050 | |
| Glucose | Roth | X997.2 | |
| HEPES | Sigma | H3375-500G | |
| NaHCO3 | Merck | K39347429847 | |
| 1mL syringes | Braun | 2016-10 | |
| 27 Gauge needles | Braun | 4657705 | |
| scalpels (#22 disposable) | Braun | BA222 | |
| Dumont #7 forceps | FST | 11271-30 | |
| Dumont 5/45 forceps | FST | 11251-35 | |
| scissors | FST | 14060-10 | |
| Iris spatula | FST | 10093-13 | |
| 70% ethanol | |||
| PBS | Life Technologies | 14040-091 | |
| flasks/well plates | TPP | 92696 | |
| PFA (4%) | Sigma | P6148 | |
| hemocytometer | Marienfeld | 650010 | |
| trypan blue (0.4%) | Sigma | T8154 | |
| NDS | Millipore | 530 | |
| TritonX-100 | Sigma | T9284 | |
| mouse monoclonal bIII-tubulin antibody | Promega | G712A | |
| rabbit polyclonal glial fibrillary acidic protein antibody | Dako | 20334 | |
| O4 | R & D systems | MAB1326 | |
| Map2a+b | Sigma | M1406 | |
| donkey anti-mouse Cy3 antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-505-151 | |
| donkey anti-rabbit Alexa488 | Dianova | 711-545-152 | |
| 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | 861405 | |
| Aqua Polymount | Polysciences Inc | 18606 | |
| 10 ml Combi tips | eppendorf | 30089677 | |
| plastic 10ml and 25mL serological pipettes | Corning | 4488/4489 | |
| EQUIPMENT | |||
| Pipetboy | Integra biosciences | 521942 | |
| multidoser pipette | eppendorf | ||
| 37C waterbath | |||
| dissecting microscope | |||
| 37C:5%Co2 incubator | |||
| centrifuge | eppendorf | 5810R |
Riferimenti
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