Her beskriver vi en detaljert protokoll for samtidig generering av nevrale forløper cellekulturer, som enten heft monolayers eller neurospheres, fra subventricular sone og dentate gyrus av individuelle voksne mus.
Den neurosphere analysen og tilhenger monolayer kultur system er verdifulle verktøy for å fastslå potensialet (spredning eller differensiering) av voksne nevrale stamceller in vitro. Disse analyser kan anvendes for å sammenligne den forløper potensialet av celler isolert fra genetisk forskjellige eller differensielt behandlede dyr for å bestemme virkningene av eksogene faktorer på neural forløper celleproliferasjon og differensiering, og for å generere nevrale forløper cellelinjer som kan bli analysert i løpet kontinuerlige passasjer. Den neurosphere assay er tradisjonelt brukt for den post-hoc-Identifikasjon av stamceller, hovedsakelig på grunn av mangel på definitiv markører som de kan bli isolert fra primær vev og har den store fordelen av å gi en rask estimat av forløper celle tall i hjernevev avledet fra enkeltdyr. Heft ettlagskulturer, i kontrast, er ikke tradisjonelt brukt for å sammenligne spredning mellom enkeltdyr, Som hver kultur blir generelt initiert fra den kombinerte vev av mellom 5-8 dyr. Men de har den store fordel at, i motsetning til neurospheres, består de av en hovedsakelig homogen populasjon av forløper-celler, og er anvendbare for å følge differensieringsprosessen i enkeltceller. Her beskriver vi i detalj, generering av neurosphere kulturer og, for første gang, heft kulturer fra enkeltdyr. Dette har mange viktige implikasjoner herunder sammenkoblet analyse av proliferasjon og / eller differensiering potensial i begge subventricular sone (SVZ) og dentate gyrus (DG) av behandlede eller genetisk forskjellige mus linjer, så vel som en signifikant reduksjon i bruken dyret.
Den neurosphere analysen 1,2 og tilhenger monokultur 3,4, begge utviklet tidlig på 1990-tallet, fortsatt gullstandarden i vitro nevrale stamceller analyser. I slike analyser, blir primær vevet mikro dissekert fra et bestemt område i hjernen, dissosiert til en enkelt cellesuspensjon og dyrket i nærvær av mitogener epidermal vekstfaktor (EGF), og fibroblast vekstfaktor-2 (FGF2) for å danne enten frittflytende klynger (neurospheres) eller tilhenger monolayers. Begge systemene har en rekke fordeler og ulemper, og nøye vurdering bør tas hensyn til spørsmålet som skal tas opp før det ene eller det annet system som er valgt.
Neurospheres tillate en enkel avlesing av forskjeller i forløper cellenummer og potensial. I tillegg neurospheres er også et nyttig verktøy for å studere iboende spesifikasjon av cellene når det fjernes fra sin normale ytre miljø. Extrinsic signaler kan studeres ved å legge den faktor av interesse for vekstmedium og kvantifisere antallet og størrelsen på neurospheres generert. Den store ulempen med neurospheres er imidlertid at de danner sin egen nisje, med cellene i sentrum av de neurospheres (særlig store neurospheres) blir mer differensiert enn de på overflaten 5. Neurospheres inneholde en blanding av stamceller, begått stamfedre, og differensierte celler og celle-celle interaksjoner innenfor neurospheres motvirke vedlikehold av stamceller. Dette er grunnen til at neurospheres inneholde bare et lite antall av sanne stamceller 6-8.
Adherente monolagskulturer også gi en god in vitro-system for å modellere in vivo spredning. Adherente kulturer, der cellene forblir mer isolert og homogen, kan eliminere den heterogene natur av neurosphere. Under disse vekstforholdene de forløper celler sprer rapidly og nesten alle celler deler seg og uttrykke de karakteristiske nevrale forløper markører Nestin, Sox2, og BLBP. Den store ulempen med monolag-dyrknings-systemet i forhold til den neurosphere analysen er at individuelle forløper-avledede kloner som er i stand til å bli overvåket og kvantifisert.
En ulempe ved de fleste protokoller for begge typer av kulturene har vært nødvendigheten av å bruke forholdsvis store antall av dyr, fordi utbyttet av isolasjons strategiene har ofte vært dårlig. På samme tid er det blitt klart at voksen neurogenesis bidrar til individualisering av hjernen 9, som resulterer i behovet for individuell ex vivo-modeller i tillegg. Disse behovene kan bli møtt av "one-mus-ett-kultur" protokoller som er beskrevet i denne rapporten.
Følgende visuell protokollen beskriver den samtidige generasjon av nevrale forløper kulturer fra både SVZ og DG av individuelle dyr enten som tilhenger monolayers eller som neurospheres. Generering av kulturer fra individuelle dyr som er spesielt nyttig når sammenligninger mellom individuelt behandlede dyr eller en rekke individuelle transgene eller villtype-mus er nødvendig. Denne protokollen inneholder detaljerte instruksjoner for samtidig microdissection av SVZ og DG regioner fra voksne mus, deres dissosiasjon inn i en enkelt celle suspensjon, in vitro kultur som enten heft ettlagskulturer eller neurospheres og analyse av multipotentiality og langsiktig potensial, de to kardinal egenskapene for en ben fide stamcelle.
Dette notatet presenterer en detaljert protokoll for initiering av nevrale forløpere i andre kulturer, både som tilhenger monolayers og neurospheres, fra de to store nevrogene områder av den voksne mus hjernen. Det er et antall viktige punkter som må tas i betraktning når man forsøker en av disse in vitro-kultursystemer. For det første, er valget av dissosiasjon metoden svært viktig og er vevet avhengig. I våre hender, er 0,05% trypsin-EDTA meget effektive for dissosiasjon av SVZ vev, og resulterer i et høyere antall neurospheres enn når man bruker et papain-baserte dissosiasjon teknikk. For dissosiasjon fra DG vev men vi anbefaler på det sterkeste en papain basert dissosiasjon tilnærming. Ved direkte sammenligning av de to dissosiasjon metoder på DG vev, observerte vi en signifikant lavere yield på levedyktige celler og ca 10 ganger færre neurospheres ved bruk av trypsin. Denne forskjell i dissosiasjon kan skyldes forskjellen i vevet composition mellom de to regionene. Den kompakte vev av DG er omgitt av omfattende neuropil og omfattende skader av cellulære prosesser kan oppstå under dissosiasjon.
Et annet viktig punkt å merke seg er at, mens neurosphere assay kan være nyttig for å gjøre kvantitative uttalelser om antall forløper-celler som er tilstede i et gitt vevsprøve, en viss forsiktighet må imidlertid anvendes i tolkningen av disse absolutte tall. Fusjon av neurospheres kan være en stor problemfaktor. Flere studier har vist at nevroner er svært bevegelige og kan smelte sammen, selv under det som er visstnok 'clonal' forhold 7,19. Den resulterende neurosphere frekvens kan være svært avhengig av faktorer, inkludert de mellom komponenter, disseksjon fremgangsmåte og dissosiasjons-prosessen. Selv mellom erfarne teleskopisk del variasjon i antall neurospheres generert fra tilsynelatende identiske prøver er åpenbart (se figur 1A.) Et stoff, er en direkte sammenligning av forløperen frekvens mellom to gitte prøver (dvs. kontroll vs behandlet eller vill-type g. knock-out) som håndteres av en og samme person i et enkelt eksperiment, i stedet for en kvantitativ angivelse av total forløper celle nummer.
Når det avgjøres hvilken av de to kulturmetoder som er mest egnet for et spesielt eksperiment, er det viktig å merke seg at disse to kultursystemer varierer i homogeniteten av de celletyper som genereres. I forhold til former adherente cellekulturer, som viser en forholdsvis homogen forløper celle basseng (~ 98% av cellene er Sox2 +) 20, neurospheres er mer heterogen, og inneholder, i tillegg til prolifererende forløper celler, differensierte neuroner og astrocytter 21,22. Det er viktig at de neurospheres ikke er dyrket i lengre perioder mellom passasjene som jo større neurosphere bli desto mer sannsynlig er det å finne differensierte celletyper i sin kjerne.
Vi tradisjonelt initiere heftmonolags nevrale forløper kulturer fra DG vev på mellom 5-8 mus. Derfor, når man forsøker å etablere de adherente monolagskulturer fra DG eller SVZ av en enkelt mus, må den ytterste forsiktighet for å bli tatt i løpet av vevet dissosiasjon fremgangsmåte for å unngå overdreven celledød forårsaket av over triturering av vevet, eller å ta forlenget perioder mellom disseksjon og endelige dyrkningstrinn. Denne protokollen beskriver, for første gang, generering av heftmonolayer forløper kulturer fra både SVZ og DG hvert enkelt dyr. Det er mange tilfeller hvor sammenligningen av forløperen proliferasjon og differensiering må gjøres på et enkelt dyr basis. Disse inkluderer muligheten til å direkte sammenligne DG og SVZ av individuelle dyr med sammenkoblede statistikk og å koble kultur data med individuelle atferdsmessige eller fysiologiske data ni. Enkelt dyr kulturer også allav bruk av sjeldne transgene dyr, hvor alders matchende en pool av 5-8 donorer per kultur ikke er mulig, samt unike dyr (f.eks F2 krysser eller ut avlet dyr) for genetiske assosiasjonsstudier.
The authors have nothing to disclose.
TLW ble støttet av et Marie Curie International Incoming Fellowship. Dette arbeidet ble også finansiert fra grunnleggende institusjonelle finansiering, für Bundesministerium Bildung og Forschung (BMBF) finansiering og delvis med støtte fra Priority Research Program (SFB) 655 i GK. Forfatterne ønsker å takke Anne Karasinsky for stell og vedlikehold av alle dyr som brukes i denne studien og Odette Leiter, Susann Ruhwald, Fanny Boehme, og Richard Wetzel for cellekultur og mikros assistanse.
CONSUMABLES | |||
poly-D-lysine | Sigma | P7280-5MG | |
laminin | Roche | 11243217001 | |
glass pastuer pipettes | Volac | BS5732 | |
DMEM:F12 (1:1) 1X | Life Technologies | 21331-020 | |
Neural Basal Medium (1X) | Life Technologies | 21103-049 | |
B27 supplements (50X) | Life Technologies | 17504-044 | |
Glutamax | Life Technologies | 35050-038 | |
Heparain | Sigma | H3393 | |
Penacillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
bFGF | PeproTech | 100-18B | |
0.05% trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | |
DNaseI | Roche | 10104159001 | |
Accutase | PAA | L11-007 | |
Papain | Worthington | LS003120 | |
Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
HBSS (with Calcium & Magnesium) | Life Technologies | 14025-050 | |
Glucose | Roth | X997.2 | |
HEPES | Sigma | H3375-500G | |
NaHCO3 | Merck | K39347429847 | |
1mL syringes | Braun | 2016-10 | |
27 Gauge needles | Braun | 4657705 | |
scalpels (#22 disposable) | Braun | BA222 | |
Dumont #7 forceps | FST | 11271-30 | |
Dumont 5/45 forceps | FST | 11251-35 | |
scissors | FST | 14060-10 | |
Iris spatula | FST | 10093-13 | |
70% ethanol | |||
PBS | Life Technologies | 14040-091 | |
flasks/well plates | TPP | 92696 | |
PFA (4%) | Sigma | P6148 | |
hemocytometer | Marienfeld | 650010 | |
trypan blue (0.4%) | Sigma | T8154 | |
NDS | Millipore | 530 | |
TritonX-100 | Sigma | T9284 | |
mouse monoclonal bIII-tubulin antibody | Promega | G712A | |
rabbit polyclonal glial fibrillary acidic protein antibody | Dako | 20334 | |
O4 | R & D systems | MAB1326 | |
Map2a+b | Sigma | M1406 | |
donkey anti-mouse Cy3 antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-505-151 | |
donkey anti-rabbit Alexa488 | Dianova | 711-545-152 | |
4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | 861405 | |
Aqua Polymount | Polysciences Inc | 18606 | |
10 ml Combi tips | eppendorf | 30089677 | |
plastic 10ml and 25mL serological pipettes | Corning | 4488/4489 | |
EQUIPMENT | |||
Pipetboy | Integra biosciences | 521942 | |
multidoser pipette | eppendorf | ||
37C waterbath | |||
dissecting microscope | |||
37C:5%Co2 incubator | |||
centrifuge | eppendorf | 5810R |