Vi præsenterer en protokol, hvordan de skal indsamle og bearbejde elektron kryo-tomogrammer af hele mitokondrier. Teknikken giver detaljerede indsigt i struktur, funktion og organisering af store membran protein komplekser i native biologiske membraner.
Electron cryo-tomografi er et kraftfuldt værktøj i strukturel biologi, er i stand til at visualisere tredimensionale struktur af biologiske prøver, såsom celler, organeller, membranvesikler eller virus ved molekylær detaljer. For at opnå dette, er vandige prøve hurtigt forglasset i flydende ethan som bevarer det i et tæt-på-nativ, frosne hydreret tilstand. I elektronmikroskop, registreres tilt serier ved flydende kvælstof temperatur, hvorfra 3D tomogrammer er rekonstrueret. Signal-til-støj-forholdet for tomografiske volumen er i sagens natur lav. Genkendelige, tilbagevendende funktioner er forstærket af subtomogram udligning, hvorved de enkelte subvoluminer er skåret ud og justeret, og i gennemsnit at reducere støj. På denne måde, 3D-kort med en opløsning på 2 nm eller bedre kan opnås. Et anfald af eksisterende strukturer i høj opløsning til 3D volumen derefter producerer atomare modeller af protein komplekser i deres oprindelige miljø. Her viser vi, hvordan vi bruger elektron kryo-tomography at studere in situ for tilrettelæggelse af store membran protein komplekser i mitokondrier. Vi finder, at ATP synthaser er organiseret i rækker af dimerer langs stærkt buede spidser af den indre membran cristae, mens komplekse jeg tilfældigt fordelt i regionerne membran på begge sider af rækkerne. Ved subtomogram gennemsnit opnåede vi en struktur af mitokondrie ATP-syntase-dimer i cristae membran.
Mitokondrier er de power-huse i cellen. Ved at konvertere en elektrokemisk protongradient over den indre mitokondrielle membran ind kemisk binding energi, mitochondrial ATP-syntase producerer de fleste af ATP, der driver cellulære processer. For at forstå mekanismerne bag mitokondrie energi konvertering, er vi nødt til at bestemme strukturen af ATP syntase in situ, og at finde ud af, hvordan det er indrettet og distribueres i den indre mitokondrielle membran. Selv om strukturer af de fleste af de mitokondrie ATP synthase komponenter 1-3 og kort lav opløsning af hele komplekset 4 høj opløsning er til rådighed, er det vigtigt at fastsætte strukturen og formen af den erhvervsaktive enzymet i membranen. Fordelingen af ATP-syntase i den indre mitokondrielle membran har været almindeligt antaget at være tilfældig, men en tidlig finde 5 og vores egne indledende resultater 6 vist, at dette ikke er than tilfælde. Efterfølgende studier fra vores gruppe og andre 7 har bekræftet, at ATP-syntase er anbragt i lange rækker af dimerer langs stramt buede kamme i den indre mitokondriemembran cristae 8, mens protonpumper elektron transportkæden synes at være placeret på begge sider af rækkerne 9. Dette arrangement har store konsekvenser for mekanismerne i mitokondrie energi konvertering.
Den teknik, som vi har anvendt til at bestemme dette arrangement er elektron cryo-tomografi (kryo-ET). Cryo-ET er i øjeblikket den eneste metode, der leverer nøjagtige tredimensionale (3D) mængder af celler, cellulære rum eller organeller på molekylær opløsning. Cryo-ET er især velegnet til at studere store komplekser i biologiske membraner, fordi membranerne ser med god kontrast og er nemme at spore i 3D tomografiske mængder.
Andre fremgangsmåder til at undersøge 3D-struktur af celler eller organelles giver ikke molekylær detalje. Super-opløsning lysmikroskopi 10, 11 er fremragende på at afsløre positionen eller afstande mellem lysemitterende etiketter til proteiner af interesse med en præcision på snesevis af nm, men det ikke afslører strukturen af selve proteinet, selv ved lav opløsning . Transmission elektronmikroskopi af serielle sektioner 12 eller blok-ansigt billeddannelse ved scanning elektronmikroskopi 13 plastik-embedded biologiske prøver har udsigt over cellulære mængder med lav opløsning, men heller ikke afsløre molekylær detalje. Atomarkraftmikroskopi 14 kan i princippet levere molekylær eller endda atomar opløsning, men kun på overfladen af objekter på en atomisk fladt, fast underlag. Endelig røntgentomografi 15 eller spredning af intense røntgen-pulser fra fri-elektron-lasere 16 er usandsynligt at afsløre strukturen af store, komplekse aperiodiske genstande som hele celler eller organeller ved molecular opløsning i en overskuelig fremtid. Således på nuværende tidspunkt, er der intet alternativ til cryo-ET til undersøgelser af 3D-strukturen af celler eller organeller i nanometer opløsning.
Cryo-ET er den foretrukne metode til at undersøge strukturen og formen af membran-associeret protein forsamlinger, herunder den komplekse kerneporen 17, influenza-spike komplekser 18, og flagellerne motoriske proteiner 22, 23 men også organiseringen af hele bakterieceller 19 og opførelse af sygdomsfremkaldende vira som HIV i til celler 20-23. Cryo-ET er uvurderlig til visualisering af trådformede proteiner og deres samspil i cellen, herunder actinfilamenter 24 eller axonemes 25. Resolutionen kan forbedres til 2 nm eller bedre ved subtomogram gennemsnit 26, hvorved subvoluminer gentagne, regelmæssige træk er skåret ud af en tomografi volumen og gennemsnit ved en enkelt-partikel billedet proikke beskadiger teknikker.
Cryo-ET indebærer erhvervelse af en serie af projektion billeder af en tynd prøve (<250 nm), der træffes på forskellige tilt vinkler i en transmissions elektron mikroskop (TEM). Prøven skal være tynd, så elektroner, der interagerer kraftigt med stof, er spredt mere end én gang. Multipel spredning gør resulterende billeder vanskelige at fortolke og reducerer kontrast. Billeder af det valgte prøve-området er justeret i forhold til hinanden og projiceret ind i et 3D-rum med et egnet computerprogram, generering af et 3D volumen af prøven. Tilpasningen af billederne er hjulpet af guld fiducial markører, som er blandet med prøven inden frysning. Ideelt 10 eller mere jævnt fordelt fiducial markører bør være til stede i hvert billede for at opnå en god tilpasning.
At observere molekylær detalje, prøver springet frosset i flydende ethan som bevarer deres oprindelige hydreret tilstand. Frysning i flydendeethan er så hurtig (~ 10 5 ° C / sek) 27, at vand ikke krystalliserer, men forbliver i en forglasset, glas-lignende tilstand. Iskrystaldannelse skader følsomme biologiske strukturer. Da biologiske prøver lider skade stråling, er der en grænse for det totale antal lysspredende begivenheder prøven kan tåle. Billeder er således erhvervet i lavdosis-mode: Et område af interesse identificeret ved lav forstørrelse (1,500X) med en elektron dosis under 1 e – / nm 2 (søgemodus). Billedet er så fokuseret på et højere forstørrelse, fra området af interesse (fokus-funktion). Kun når et billede er erhvervet, er området af interesse bestrålet med en højere dosis elektron (eksponering tilstand).
Her præsenterer vi et overblik over, hvordan de skal indsamle og bearbejde elektron cryo-tomogrammer, ved hjælp af ATP syntase dimerer i den indre mitokondrielle membran som et eksempel. Følgende protokol beskriver, hvordan man forbereder mitochondrier til cryo-ET, hvordan du opsætterog indsamle en tilt serie med en specifik samlet elektron dosis, og hvordan at behandle tilt serie til opnåelse af et 3D volumen af området af interesse. En oversigt over den procedure, er illustreret i figur 1.
Protokollen præsenteres her giver en introduktion til kryo-ET og subtomogram midling af mitokondrier, men i det væsentlige den samme procedure kan anvendes til en anden celle rum eller membran. For at opnå de bedst mulige data, kritiske trin under proceduren er prøveforberedelse, springet nedfrysningsprocessen og data opkøbsstrategi. Prøve kvalitet, som er afgørende for succes, afhænger af en optimeret nedfrysning for at sikre passende isens tykkelse, som er af afgørende betydning for et godt billede kontrast. Den optimale opkøbsstrategi data afhænger af instrumentet og prøve. Parametre, der skal optimeres omfatter elektron dosis pr billede, tilt ordningen og Defocus. Erhvervelse en god tomogram af en god prøve gør hele yderligere behandling skridt lettere og sikrer et tilfredsstillende slutresultat.
Cryo-ET kombineret med subtomogram udjævning og atommodel montering indeholder oplysninger om, hvordan protein-komplekser er arrangeret i their Native cellulære miljø. Teknikken er velegnet til at undersøge strukturen af store membranprotein komplekser, såsom respiratoriske kæde supercomplexes (1,7 MDA), ATP synthase dimerer (2×500 kDa) eller kerneporen kompleks (~ 120 MDa) 8, 9, 17. Organiseringen af ATP synthase dimerer i rækker ikke kan observeres ved hjælp af teknikker med høj opløsning, såsom røntgenkrystallografi, NMR eller single-partikel kryo-EM, fordi dimeren rækker er forstyrret af detergentekstraktion, hvilket er et nødvendigt skridt i isolation og oprensning af membran-proteinkomplekser.
Arrangementet af ATP syntase i rækker af dimerer langs cristae kamme er et universelt organisationsprincip i mitokondrier i alle arter. Proton-pumpende komplekser af elektron transportkæde, især komplekse I (NADH dehydrogenase), er placeret i membranen områder på hver side af rækkerne 8,9. Denne organisation af det respiratoriske kæde har dybtgående indvirkning på mitokondrie bioenergetik. Hvis dimer rækker ikke kan dannes på grund af fravær af dimer-specifikke protein-subunits, cellerne udviser længere generation og færre cellulære egnethed, som observeret i gærmutant vist i figur 3 41. Med den stigende interesse for mitokondrie-sygdomme en detaljeret forståelse af det molekylære grundlag regulerer mitokondrie ultrastruktur og funktion er af afgørende betydning. Electron cryo-tomografi giver en sammenhæng mellem proteinstruktur bestemt ved høj opløsning metoder, og fordelingen og arrangementet af disse proteiner i membranen på omfanget af nanometer. Dette gør cryo-ET et vigtigt redskab til at forstå mitokondrie struktur og funktion i sundhed og sygdom.
Yderligere tekniske udviklinger og forbedringer i cryo-ET omfatter protein-mærkning af strategier til at identificere placeringen af Protein underenheder i makromolekylære komplekser eller placeringen af mindre eller mindre distinkte proteiner (<0,5 MDA) i celler. Desuden har hybrid EM forarbejdningsmetoder, der kombinerer subtomogram gennemsnitsberegning med enkelt partikel analyse eller spiralformet rekonstruktion nylig fastsat proteinstrukturer til ~ 8 A 42, 43. Disse forarbejdningsmetoder er i øjeblikket begrænset til oprensede proteiner, der er godt adskilt i is eller danner spiralformede forsamlinger og er i øjeblikket ikke anvendelse på overfyldte cellulære miljøer som mitokondrier og cristae membraner. For dataindsamling er nye computing og hardware værktøjer blive udviklet til at muliggøre automatiseret tomogram erhvervelse, øge billedets kontrast og reducere det samlede krævede elektron dosis. Den eneste grundlæggende begrænsning i kryo-ET er stråleskader til prøven af elektronstrålen. Dette betyder, at doser kun meget lave elektron kan bruges til at optage hvert billede af en tomografisk tilt serie, hvilket resulterer i dårligt signal-to-støj-forhold, som i sidste ende begrænser den opnåelige opløsning. De nye direkte elektron detektorer, udgivet mindre end et år siden, er i øjeblikket revolutionere området for enkelt-partikel kryo-EM 44, 45. Disse nye detektorer giver højere kontrast og bedre opløsning ved lavere doser elektron. For elektron kryo-tomografi, betyder det, at tilt-serie med mindre skridt størrelser eller endda dobbelt akse tomogrammer kan indsamles uden bekymringer om overdreven stråleskader (en CCD-billedsensor er tilsvarende i elektron dosis til 5 direkte elektron detektor billeder). De enorme mængder af data, der produceres af disse detektorer skabe deres egne udfordringer i data håndtering, forarbejdning og oplagring, der bliver nødt til at blive overvundet.
Desuden faseplader, der arbejder på de samme principper som dem, der anvendes rutinemæssigt i lysmikroskopi at forbedre fasekontrast, bliver i øjeblikket udviklet til transmission elektronmikroskopi 46, 47.. Dette skulle give tomogrammer skal indsamles nærmere at fokusere og dermed en højere opløsning, mens den på samme tid bevarer lav opløsning funktioner der er nødvendige for tilpasning og fortolkning af tomografiske mængder. Tilsammen vil disse teknologiske fremskridt i høj grad udvide den række af biologiske spørgsmål, der kan løses ved cryo-ET.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Max Planck Society (KMD, BD, AWM, tuberkulose, TBB, DJM, og WK), Cluster Excellence Frankfurt "makromolekylære Komplekser" finansieret af Deutsche Forschungsgemeinschaft (WK) og en postdoc EMBO Langsigtet Fellowship (VAMG).
Sucrose | ROTH | 4621.2 | |
Trehalose | Sigma-Aldrich | T9449 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Zymolase | biomol | Z1000.1 | |
Density gradient medium | Sigma-Aldrich | D1556 or P1644 | |
Protein A gold | Aurion | 810.111 | 10 nm |
Ethane | Air Liquide | P0502S02R0A001 | |
Nitrogen | Air Liquide | I4150RG | |
Consumables | |||
Filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1004 090 | Nr 4 |
Tweezers | Dumont | T506 | Non-magnetic, pattern #5 |
EM combined test grid | Plano GmbH | S142 | grapite and gold islands on holey carbon film |
Holey carbon grids | Quantifoil Micro Tools GmbH or C-flat | R2/2 300 Cu mesh | |
Cryo grid boxes | Plano GmbH | 160-42 | Alternative home-made metal boxes |
Equipment | |||
Potter | Sigma-Aldrich | P7984 | |
Blender | Waring | 8011S | |
Glass bead mill – bead beater | BioSpec Products | 1107900-105 | Including 0.5 mm beads |
Ball-bearing (Balch) homogeniser | isobiotec | H8 | |
Centrifuge | Thermo Scientific | 46915 | Sorvall RC6+ |
Glow-discharge apparatus | Bal-Tec A.G. | CTA 010 | |
Grid vitrification device | FEI, Gatan or Leica | Alternative home-made plunger | |
Transmission electron microscope | FEI or Jeol | 300 keV | |
Direct electron detector (CMOS) | Gatan | 4k x 4k pixels, counted mode | |
Charge coupled device | Gatan | 4K x 4K pixels (alternative to Direct electron detector) | |
Energy filter | Gatan or Jeol | ||
Software | |||
Image acquisition software | Gatan | ||
Tomogram acquisition software | Gatan, FEI, USCF, or UC-Boulder | 4 alternatives | |
Tomogram processing software | FEI, UCSF or UC-Boulder | 3 alternatives | |
Subtomogram averaging software | UC-Boulder, or University of Basel | 2 alternatives | |
Tomogram visualisation software | UC-Boulder, FEI, or University of Utah | 3 alternatives | |
visualisation software plugin | Goethe university | http://www.biophys.uni-frankfurt.de/frangakis/ | |
Structure visualisation software | UCSF | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | |
Numerical calculation software | MathWorks | http://www.mathworks.de/academia/ |