Nous présentons un protocole sur la façon de recueillir et électronique de processus cryo-tomographie de mitochondries entières. La technique donne un aperçu détaillé de la structure, la fonction et l'organisation de grands complexes de protéines membranaires en membranes biologiques indigènes.
Electron cryo-tomographie est un outil puissant dans la biologie structurale, capable de visualiser la structure tridimensionnelle d'échantillons biologiques, tels que des cellules, des organites, des vésicules membranaires ou des virus dans des détails moléculaire. Pour ce faire, l'échantillon aqueux est rapidement vitrifié dans l'éthane liquide, qu'il conserve dans un état congelé-hydraté proche de l'origine. Au microscope électronique, les séries d'inclinaison sont enregistrés à la température de l'azote liquide, à partir de laquelle on reconstruit des tomographies 3D. Le rapport signal-sur-bruit du volume tomographique est intrinsèquement faible. Reconnaissables, caractéristiques récurrentes sont renforcées par subtomogram moyenne, qui sous-volumes individuels sont découpés, alignés et moyenne pour réduire le bruit. De cette manière, les cartes 3D avec une résolution de 2 nm ou plus peut être obtenu. Un ajustement des structures disponibles en haute résolution pour le volume 3D produit alors des modèles atomiques de complexes de protéines dans leur environnement natif. Ici, nous montrons comment nous utilisons cryo-tomography pour étudier l'organisation in situ de grands complexes de protéines membranaires dans les mitochondries. Nous constatons que les ATP synthases sont organisées en rangées le long des sommets de dimères à forte courbure de la membrane intérieure de crêtes, alors que le complexe I est distribuée de manière aléatoire dans les régions de la membrane de part et d'autre des rangées. Par subtomogram moyenne, nous avons obtenu une structure de l'ATP synthase mitochondriale le dimère à l'intérieur de la membrane de crêtes.
Les mitochondries sont les centrales d'énergie de la cellule. Par conversion d'un gradient de proton électrochimique à travers la membrane mitochondriale interne en énergie de liaison chimique, l'ATP synthase mitochondriale produit la plupart de l'ATP qui entraîne des processus cellulaires. Afin de comprendre les mécanismes sous-jacents conversion d'énergie mitochondriale, nous avons besoin de déterminer la structure de l'ATP synthase in situ, et pour savoir comment il est organisé et distribué dans la membrane mitochondriale interne. Bien que les structures à haute résolution de la plupart des composants mitochondriaux de l'ATP synthase 3.1 et cartes à faible résolution de l'ensemble du complexe 4 sont disponibles, il est important d'établir la structure et la conformation de l'enzyme active dans la membrane. La distribution de l'ATP synthase dans la membrane mitochondriale interne a été largement supposé être aléatoire, mais un début de trouver 5 et nos propres résultats initiaux 6 indiqué que ce n'est pas til cas. Des études ultérieures de notre groupe et d'autres 7 ont confirmé que l'ATP synthase est disposé dans de longues rangées de dimères sur les crêtes étroitement courbes de la mitochondriale interne crêtes de la membrane 8, tandis que les pompes à protons de la chaîne de transport d'électrons semblent être situés de chaque côté des lignes 9. Cette disposition a d'importantes implications pour les mécanismes de conversion d'énergie mitochondriale.
La technique que nous avons utilisée pour déterminer cette disposition est cryo-tomographie (cryo-ET). Cryo-ET est actuellement la seule méthode qui offre précises volumes en trois dimensions (3D) de cellules, des compartiments cellulaires ou des organites à une résolution moléculaire. Cryo-ET est particulièrement adapté à l'étude de grands complexes dans les membranes biologiques, car les membranes apparaissent avec un bon contraste et sont faciles à tracer des volumes tomographiques en 3D.
D'autres méthodes pour étudier la structure 3D de cellules ou organelles ne donnent pas de détails moléculaire. Super-résolution de la microscopie à lumière 10, 11 est excellent en révélant la position ou la distance entre les marqueurs luminescents liés à des protéines d'intérêt avec une précision de quelques dizaines de nm, mais il ne révèle pas la structure de la protéine elle-même, même à basse résolution . microscopie électronique à transmission de coupes en série 12 ou imagerie îlot par microscopie électronique à balayage 13 d'échantillons biologiques plastique intégré offrent une vue basse résolution de volumes cellulaires, mais également ne pas révéler les détails moléculaire. La microscopie à force atomique 14 peut en principe délivrer résolution moléculaire ou atomique même, mais seulement à la surface des objets sur un support solide atomiquement plat. Enfin, tomographie par rayons X 15 ou diffusion de intenses impulsions de rayons X par des lasers à électrons libres 16 est peu probable pour révéler la structure de grands complexes, objets apériodiques comme les cellules ou les organites entiers à mrésolution olecular dans un avenir prévisible. Ainsi à l'heure actuelle, il n'y a pas d'alternative à cryo-ET pour les études de la structure 3D de cellules ou organites à résolution nanométrique.
Cryo-ET est la méthode de choix pour l'examen de la structure et la conformation des assemblages de protéines associées à la membrane, y compris le complexe du pore nucléaire 17, le pic de la grippe se complexe 18, et les flagelles des protéines motrices 22, 23, mais également l'organisation des cellules bactériennes entières 19 et l'entrée de virus pathogènes comme le VIH dans les cellules 20-23. Cryo-ET est inestimable pour la visualisation de protéines filamenteuses et leurs interactions dans la cellule, dont les filaments d'actine 24 ou axonèmes 25. La résolution peut être améliorée à 2 nm ou mieux par subtomogram moyenne 26, dans lequel sont découpées sous-volumes de répétition, des traits réguliers sur un volume tomographique et en moyenne par une particule d'image prodes techniques de transformation.
Cryo-ET comprend l'acquisition d'une série d'images de projection d'un spécimen mince (<250 nm d') prises sous différents angles d'inclinaison dans un microscope électronique à transmission (MET). Le spécimen doit être mince pour que des électrons qui interagissent fortement avec la matière, sont dispersés plus d'une fois. Diffusion multiple rend les images qui en résultent difficiles à interpréter et réduit le contraste. Les images de la zone sélectionnée de l'échantillon sont alignés par rapport à l'autre et prévus dans un espace 3D par un programme informatique approprié, la génération d'un volume 3D de l'échantillon. L'alignement des images est assisté par marqueurs fiduciaires or, qui sont mélangés avec l'échantillon avant la congélation. Marqueurs fiduciaires Idéalement 10 ou plus uniformément réparties doivent être présents dans chaque image pour obtenir un bon alignement.
Pour observer en détail moléculaire, les échantillons sont congelés plongée dans l'éthane liquide, ce qui préserve leur état hydraté natif. Congélation en liquideéthane est si rapide (~ 10 5 ° C / s) 27 que l'eau ne cristallise pas, mais reste dans un état vitrifié, semblable à du verre. cristaux de glace des dommages-intérêts de la formation des structures biologiques sensibles. Comme échantillons biologiques souffrent de dégâts d'irradiation, il existe une limite pour le nombre total d'événements de diffusion de l'échantillon peut tolérer. Les images sont ainsi acquises en mode à faible dose: Une zone d'intérêt est identifié à faible grossissement (1,500X) avec une dose d'électrons inférieure à 1 e – / nm 2 (mode de recherche). L'image est ensuite porté à un plus fort grossissement, hors de la zone d'intérêt (mode de mise au point). Ce n'est que lorsque l'image est acquise, la zone d'intérêt est irradié avec une dose plus élevée d'électrons (mode d'exposition).
Ici, nous présentons un aperçu de la façon de recueillir et d'électrons de processus cryo-tomographie, en utilisant de l'ATP synthase dimères dans la membrane mitochondriale interne comme un exemple. Le protocole suivant décrit comment préparer les mitochondries pour cryo-ET, comment mettre en placeet collecter une série d'inclinaison avec une dose d'électrons totale spécifique, et la manière de traiter la série d'inclinaison pour obtenir un volume 3D de la zone d'intérêt. Une vue d'ensemble de la procédure est illustrée sur la figure 1.
Le protocole présenté ici fournit une introduction de cryo-ET et subtomogram moyenne des mitochondries, mais essentiellement la même procédure peut être appliquée à n'importe quel autre compartiment de la cellule ou de la membrane. Pour obtenir les meilleures données possibles, les étapes critiques de la procédure sont la préparation des échantillons, la stratégie d'acquisition de données et des processus de congélation plongeon. Qualité échantillon, ce qui est essentiel pour le succès, dépend d'un protocole de congélation optimisé pour garantir une épaisseur de glace appropriée, qui est d'une importance primordiale pour un bon contraste d'image. La stratégie optimale d'acquisition de données dépend de l'instrument et de l'échantillon. Paramètres à optimiser comprennent dose d'électrons par image, système d'inclinaison et défocalisation. L'acquisition d'une bonne tomographie d'un bon échantillon rend tout traitement ultérieur étapes plus facile et assure un résultat final satisfaisant.
Cryo-ET combiné avec subtomogram moyenne et atomique ajustement du modèle fournit des détails sur la façon dont les complexes de protéines sont disposées en eenvironnement cellulaire natif leu. La technique est également adaptée à l'étude de la structure de grands complexes de protéines membranaires, tels que supercomplexes respiratoires de chaîne (1,7 MDA), les dimères de l'ATP synthase (2×500 kDa), ou le complexe du pore nucléaire (~ 120 MDa) 8, 9, 17. L'organisation de l'ATP dimères synthase en lignes ne peut être observée par des techniques à haute résolution tels que la cristallographie aux rayons X, RMN ou une particule cryo-EM, parce que les rangées de dimères sont perturbés par extraction au détergent, qui est une étape nécessaire dans l'isolement et la purification de complexes protéiques de la membrane.
L'agencement de l'ATP synthase dans des rangées de dimères long des crêtes de crêtes est un principe d'organisation universelle des mitochondries dans toutes les espèces. Les complexes de pompage de protons de la chaîne de transport d'électrons, en particulier complexe I (NADH déshydrogénase), sont situés dans les zones de chaque côté des rangées de membrane 8,9. Cette organisation de la chaîne respiratoire a un impact profond sur la bioénergétique mitochondriale. Si les rangées de dimères ne peuvent se former en raison de l'absence de sous-unités protéiques spécifiques aux dimères, les cellules présentent des temps de génération et de remise en forme cellulaire réduite, comme observé dans le mutant de levure représenté sur la figure 3 41. Avec l'intérêt croissant pour les maladies mitochondriales, un détail compréhension de la base moléculaire régissant ultrastructure et la fonction mitochondriale est d'une importance primordiale. Cryo-tomographie fournit un lien entre la structure de la protéine déterminée par des méthodes à haute résolution, et la distribution et la disposition de ces protéines dans la membrane à l'échelle du nanomètre. Cela rend cryo-ET un outil essentiel pour comprendre la structure et la fonction mitochondriale dans la santé et la maladie.
Développements et améliorations techniques complémentaires en cryo-ET comprennent des stratégies protéine d'étiquetage pour identifier la position de protein sous-unités dans des complexes macromoléculaires ou la localisation de protéines distinctes plus petites ou moins (<0,5 Mda) dans les cellules. En outre, les méthodes de traitement hybride EM, qui se combinent avec une moyenne subtomogram analyse de particules isolées ou de reconstruction hélicoïdale ont récemment déterminé les structures des protéines à ~ 8 A 42, 43. Ces méthodes de traitement sont actuellement limitées aux protéines purifiées, qui sont bien séparés dans la glace ou forment des ensembles hélicoïdaux et sont actuellement pas applicable aux environnements cellulaires très fréquentés comme les mitochondries et les membranes des crêtes. Pour la collecte des données, de nouveaux outils informatiques et de matériel sont en cours d'élaboration pour permettre l'acquisition de tomographie automatisée, augmenter le contraste d'image et de réduire la dose totale d'électrons nécessaire. La seule limitation fondamentale dans cryo-ET est dégâts d'irradiation de l'échantillon par le faisceau d'électrons. Cela signifie que seulement de très faibles doses d'électrons peuvent être utilisés pour enregistrer chaque image d'une série d'inclinaison tomographique, entraînant un mauvais rapport signal trapport qui limite finalement la résolution réalisable o-bruit. Les nouveaux détecteurs d'électrons directe, publié il ya moins d'un an, sont actuellement en train de révolutionner le domaine de la seule particule cryo-EM 44, 45. Ces nouveaux détecteurs offrent un contraste plus élevé et une meilleure résolution à des doses plus faibles d'électrons. Par cryo-tomographie, cela signifie que les séries de basculement avec de plus petites tailles de pas ou des tomographies de l'axe même doubles peuvent être collectées sans s'inquiéter de dégâts d'irradiation excessive (une image CCD est équivalente à la dose d'électrons de 5 images directes de détecteur d'électrons). Les vastes quantités de données produites par ces détecteurs de créer leurs propres défis en matière de manutention, le traitement et le stockage, qui devront être surmontés.
En outre, les plaques de phase, qui fonctionnent sur les mêmes principes que ceux qui sont utilisés en routine dans la microscopie optique pour augmenter le contraste de phase, sont actuellement en cours de développement pour la microscopie électronique à transmission 46, 47. Cela devrait permettre tomographies à collecter plus proche de focaliser et donc à la résolution plus élevée, tout en préservant en même temps basse résolution propose nécessaire pour l'alignement et l'interprétation des volumes tomographiques. Pris ensemble, ces avancées technologiques seront grandement élargir la gamme des questions biologiques qui peuvent être traités par cryo-ET.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par la Société Max Planck (KMD, BD, MN, la tuberculose, TBB, DJM, et WK), le pôle d'excellence de Francfort "macromoléculaires complexes», financé par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (WK) et un EMBO long terme postdoctoral Fellowship (VAMG).
Sucrose | ROTH | 4621.2 | |
Trehalose | Sigma-Aldrich | T9449 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Zymolase | biomol | Z1000.1 | |
Density gradient medium | Sigma-Aldrich | D1556 or P1644 | |
Protein A gold | Aurion | 810.111 | 10 nm |
Ethane | Air Liquide | P0502S02R0A001 | |
Nitrogen | Air Liquide | I4150RG | |
Consumables | |||
Filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1004 090 | Nr 4 |
Tweezers | Dumont | T506 | Non-magnetic, pattern #5 |
EM combined test grid | Plano GmbH | S142 | grapite and gold islands on holey carbon film |
Holey carbon grids | Quantifoil Micro Tools GmbH or C-flat | R2/2 300 Cu mesh | |
Cryo grid boxes | Plano GmbH | 160-42 | Alternative home-made metal boxes |
Equipment | |||
Potter | Sigma-Aldrich | P7984 | |
Blender | Waring | 8011S | |
Glass bead mill – bead beater | BioSpec Products | 1107900-105 | Including 0.5 mm beads |
Ball-bearing (Balch) homogeniser | isobiotec | H8 | |
Centrifuge | Thermo Scientific | 46915 | Sorvall RC6+ |
Glow-discharge apparatus | Bal-Tec A.G. | CTA 010 | |
Grid vitrification device | FEI, Gatan or Leica | Alternative home-made plunger | |
Transmission electron microscope | FEI or Jeol | 300 keV | |
Direct electron detector (CMOS) | Gatan | 4k x 4k pixels, counted mode | |
Charge coupled device | Gatan | 4K x 4K pixels (alternative to Direct electron detector) | |
Energy filter | Gatan or Jeol | ||
Software | |||
Image acquisition software | Gatan | ||
Tomogram acquisition software | Gatan, FEI, USCF, or UC-Boulder | 4 alternatives | |
Tomogram processing software | FEI, UCSF or UC-Boulder | 3 alternatives | |
Subtomogram averaging software | UC-Boulder, or University of Basel | 2 alternatives | |
Tomogram visualisation software | UC-Boulder, FEI, or University of Utah | 3 alternatives | |
visualisation software plugin | Goethe university | http://www.biophys.uni-frankfurt.de/frangakis/ | |
Structure visualisation software | UCSF | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | |
Numerical calculation software | MathWorks | http://www.mathworks.de/academia/ |