Biz toplamak ve tüm mitokondri süreç elektron cryo-tomografi nasıl bir protokol mevcut. Teknik, doğal biyolojik membranların büyük membran protein komplekslerinin yapısı, işlevi, ve organizasyon hakkında detaylı bilgiler sağlar.
Elektron cryo tomografi gibi moleküler ayrıntılı olarak hücrelere, organel, zar veziküllerinin ya da virüsler gibi biyolojik örnekler, üç-boyutlu bir yapıya sahip görselleştirme yapısal biyolojide güçlü bir araçtır. Bunu elde etmek için, sulu bir örneği hızla bir yakın-yerli, dondurulmuş sulu halde de korur sıvı etan, içinde vitrifiye edildi. Elektron mikroskobu, tilt serisi 3D tomografi yeniden oluşturulmasını sağlayan sıvı azot sıcaklığında kaydedilir. Tomografik hacminin sinyal-gürültü oranı doğal düşüktür. Tanınabilir, yinelenen özellikleri, bireysel hacimler, kesip hizalanmış ve gürültüyü azaltmak için ortalama tarafından hangi subtomogram ortalamaya tarafından geliştirilmiş. Bu şekilde, 3 boyutlu elde edilebilir 2 nm ya da daha iyi bir çözünürlüğe sahip eşleştirir. 3D hacmine kullanılabilir yüksek çözünürlüklü yapıların bir uyum sonra kendi doğal ortamında protein kompleksleri atom modelleri üretiyor. Burada biz elektron cryo-tomograp kullanımı nasıl göstermekhy mitokondri büyük membran protein kompleksleri yerinde organizasyonu incelemek. Karmaşık rasgele sıraların her iki tarafında membran bölgeleri dağıtılır ise ATP sentez, iç membran krista derece eğimli uçları dışa boyunca dimerlerin sıralar halinde organize olduğunu bulmak. Subtomogram ortalama alma terimi ile krista zarı içinde mitokondriyal ATP sentetaz dimerinin bir yapı elde edilmiştir.
Mitokondri hücrenin güç evler. Kimyasal bağ enerji içine iç mitokondrial membran genelinde bir elektrokimyasal proton degrade dönüştürerek, mitokondriyal ATP sentaz hücresel süreçleri sürücüler ATP'nin en üretir. Mitokondrial enerji dönüşümü arkasındaki mekanizmaları anlamak için, biz yerinde ATP sentaz yapısını belirlemek için, ve düzenlenmiş ve iç mitokondrial membran nasıl dağıldığını bulmak gerekir. Tüm karmaşık 4 mitokondrial ATP sentetaz bileşenleri 1-3 ve düşük çözünürlüklü haritalar çoğu yüksek çözünürlüklü yapılar mevcut olmakla birlikte, bu membran, işçi enzimin yapısını ve bir biçimini oluşturmaktır önemlidir. Iç mitokondrial membran ATP sentaz dağılımı yaygın olarak rastgele olduğu varsayılır, ancak 6 bu t değil belirtti 5 ve kendi ilk sonuçları erken olmuşturO durumda. Elektron taşıma zincirinin proton pompa her iki tarafında bulunduğu görülür iken sonradan bizim gruptan çalışmalar ve diğerleri 7, ATP sentaz iç mitokondrial membran kristalarında 8 sıkıca kavisli sırtlar boyunca dimerlerinin uzun sıralar halinde düzenlenmiş olduğunu doğruladı Sıralar 9. Bu düzenleme mitokondriyal enerji dönüşüm mekanizmalarının önemli etkileri vardır.
Biz bu düzenlemeyi belirlemek için kullandık tekniği elektron cryo-tomografi (cryo-ET) 'dir. Cryo-ET şu anda moleküler çözünürlükte hücreler, hücre bölmeleri veya organellerin doğru üç boyutlu (3D) hacimlerini veren tek yöntemdir. Zarlar iyi kontrast görünür ve 3D tomografik hacimlerde iz kolay çünkü cryo-ET, biyolojik zarların büyük kompleksleri eğitim için uygundur.
Diğer yöntemler, hücrelerin veya organell 3D yapısını incelemek içines moleküler detay vermeyin. Süper çözünürlük ışık mikroskobu 10, 11 pozisyon veya nm onlarca hassasiyetle ilgi proteinlere bağlı ışık yayan etiketler arasındaki mesafeleri ortaya çıkarmayı mükemmel, ama bu bile düşük çözünürlükte, proteinin kendi yapısını ortaya koymuyor . Plastik-gömülü biyolojik numunelerin elektron mikroskobu 13 taramalı seri bölümleri 12 ya da blok-yüz görüntüleme transmisyon elektron mikroskopisi, hücre hacimlerinin düşük çözünürlüklü manzaralar sunar ama aynı şekilde moleküler detay ortaya koymuyoruz. Atomik kuvvet mikroskobu 14 prensip moleküler hatta atomik çözünürlük sunuyor, ama sadece bir atomik düz, katı destek nesnelerin yüzeyinde olabilir. Son olarak, X-ışını tomografisi 15 ya da serbest elektron lazerleri yoğun X-ışını palslarının saçılma örneğin 16 m bütün hücrelerin veya organel olarak büyük, kompleks, aperiyodik nesne yapısını ortaya çıkarmak için pek mümkün değildiröngörülebilir gelecekte olecular çözünürlük. Böylece şu anda, nanometre çözünürlükte hücreleri veya organellerin 3D yapı çalışmaları için-ET cryo için hiçbir alternatif yoktur.
Kriyo-ET, çekirdek gözenek kompleks 17, grip başak 18 kompleksleri de dahil olmak üzere zara bağlı protein düzeneklerinin yapısını ve şeklini incelenmesi için tercih edilen bir yöntem, ve kamçı motor proteinleri, 22, 23, aynı zamanda, tüm bakteri hücreleri 19 arasında organizasyon hücrelerde 20-23 ile HIV gibi patojenik virüslerin ve giriş. Cryo-ET aktin filamentler 24 veya axonemes 25 dahil ipliksi proteinler ve hücre içindeki etkileşimleri, görselleştirmek için paha biçilmezdir. Çözünürlüğü tekrar düzenli özellikler hacimler tek parçacık Image Pro bir tomografik birimin kesilmiş ve ortalaması alınır ve bu sayede subtomogram, 26, ortalama 2 nm ya da daha iyi arttırılabilircessing teknikleri.
Cryo-ET transmisyon elektron mikroskobu (TEM) farklı tilt açıları alınan ince bir örneğinin (<250nm) projeksiyon görüntüleri bir dizi satın içerir. Madde ile kuvvetli bir etkileşimi elektronlar, birden fazla dağılmış şekilde örnek ince olmalıdır. Çoklu saçılma yorumlamak çıkan görüntülerin zorlaştırır ve kontrastı azaltır. Seçilen örnek alanın Görüntüler her bir diğerine göre hizalanmış ve numunenin bir 3D hacmi üretme, uygun bir bilgisayar programı tarafından 3D uzaya yansıtılır. Görüntülerin hizalama dondurma öncesi numune ile karıştırılır altın yanlılık belirteçleri tarafından desteklenir. İdeal olarak 10 ya da daha fazla eşit dağıtılmış yanlılık belirteçler iyi bir uyum elde etmek için, her bir görüntü mevcut olmalıdır.
Moleküler ayrıntı gözlemek için, numuneler dalma-dondurulmuş onların yerli hidrate durumunu korur sıvı etan, vardır. Bir sıvı içinde dondurulmasıetan kadar hızlı (~ 5 ° 10 ° C / sn) su kristalize ama vitrifiye, cam benzeri durumda kalır değil 27. Buz kristallerinin oluşması zarar verir ve hassas biyolojik yapıları. Biyolojik örnekler radyasyon hasarı muzdarip gibi, numune tahammül saçılma olaylarının toplam sayısı için bir sınır yoktur. Görüntüler böylece düşük doz modunda edinilen: ilgi alanı 1 e altında bir elektron doz düşük büyütme (1,500X) tespit edilir – / 2 nm (arama modu). Görüntü daha sonra faiz (odak modu) alanı kapalı, yüksek büyütmede odaklanmıştır. Bir görüntü elde edilir sadece, ilgi alanı yüksek bir elektron dozda (pozlama modu) ile ışınlanır.
Burada, bir örnek olarak iç mitokondrial membran ATP sentaz dimerleri kullanarak toplama ve proses elektron cryo-tomografi için nasıl bir bakış sunacak. Aşağıdaki protokol cryo-ET için mitokondri nasıl hazırlanacağını anlatır, nasıl kurmakve belirli bir toplam elektron dozu ve nasıl ilgi alanındaki bir 3 boyutlu hacim elde etmek için tenteli serisi işlemek için olan bir eğim dizi toplamak. Işlem bir genel görünüşü Şekil 1'de gösterilmiştir.
Burada sunulan protokol ve mitokondri subtomogram ortalamasını ET-kriyo bir giriş sağlar, ancak esas itibariyle aynı prosedürü herhangi bir başka hücre bölmesi veya membrana uygulanabilir. Mümkün olan en iyi verileri elde etmek için, işlem sırasında kritik adımlar numune hazırlama, dalma dondurma işlemi ve veri toplama stratejisi vardır. Başarı için kritik olan örnek kalitesi, iyi görüntü kontrastı için büyük önem taşımaktadır uygun buz kalınlığının sağlanması için optimize edilmiş bir donma protokolü bağlıdır. En iyi veri elde etme stratejisi cihaz ve örnek bağlıdır. Optimize edilmesi Parametreler görüntü başına elektron doz, eğim düzeni ve bulanıklaştırma bulunmaktadır. İyi bir örnek iyi bir tomogram Kazanılması bütün işleme kolay adımları ve tatmin edici bir uç sonuç sağlar yapar.
Cryo-ET subtomogram ortalama alma ve atom modeli montaj ile kombine protein kompleksleri inci nasıl düzenlenir ayrıntılarını sağlarEIR yerli hücresel ortamı. Bu teknik, örneğin solunum zinciri supercomplexes (1.7 MDA), ATP sentetaz dimerlerinden oluştuğunu gösterir (2×500 kDa), ya da çekirdek gözenek kompleks (~ 120 MDA) 8, 9, 17 gibi büyük bir zar protein kompleksleri, yapısını araştırmak için de aynı derecede uygundur. Dimer satırlar izolasyonu gerekli bir adımdır deterjan ekstraksiyon, bozulur çünkü satır içine ATPsentaz dimerlerinin organizasyonu, örneğin X-ışını kristalografisi, NMR veya tek-parçacık cryo-EM gibi yüksek çözünürlüklü teknikleri ile görülemez ve membran protein komplekslerinin saflaştırılması.
Kristalarında sırtlarda dimerlerinin satır ATP sentaz düzenlemesi bütün türlerin mitokondri evrensel bir örgütlenme ilkesidir. Elektron nakil zincirinin proton pompalama kompleksleri, özel komplekse, I (NADH dehidrojenaz), ya da yan satır 8 zarı alanları bulunur9. Solunum zinciri Bu organizasyon mitokondriyal Bioenerji üzerinde derin bir etkisi vardır. Dimer satır bağlı dimer özel protein alt birimlerinin olmaması oluşturamazsa, Şekil 3 41'de gösterilen maya mutant de görüldüğü gibi, hücreler daha uzun üretim süresi ve düşük hücresel uygunluk gösterirler. Mitokondriyal hastalıklarda artan ilgi ile, detaylı bir mitokondriyal ultrastrüktürünü ve işlevini yöneten moleküler temeli anlaşılması önem taşımaktadır. Elektron cryo tomografi nanometre ölçeğinde zar protein yüksek çözünürlüklü metodlarla tespit yapısı ve dağılımı ve bu proteinlerin düzenleme arasında bir bağlantı sağlar. Bu cryo-ET sağlığı ve hastalıkları, mitokondriyal yapısını ve işlevini anlamak için gerekli bir araç yapar.
Cryo-ET de teknik ilerlemeler ve gelişmeler Protei konumunu belirlemek için protein etiketleme stratejileri içerirmakromoleküler kompleksleri n alt üniteleri veya hücrelerde daha küçük veya daha az farklı proteinlerin yeri (<0.5 MDa). Ayrıca, tek parçacık analizi veya sarmal imarlı subtomogram ortalamasını birleştiren hibrid EM işleme yöntemleri, son zamanlarda protein yapılarını tespit ettik Å 42, 43 8 ~ için. Bu işleme yöntemleri şu anda iyi buz ayrılmış veya sarmal meclisleri oluşturmak ve şu anda mitokondri gibi kalabalık ortamlarda hücresel için geçerli değildir ve membranlar kristalarında olan saflaştırılmış proteinlerin, kısıtlanır. Veri toplama için yeni bilgisayar ve donanım araçları, otomatik tomogram satın izin görüntü kontrastını artırmak ve gereken toplam elektron dozu azaltmak için geliştirilmektedir. Kriyo-ET tek temel sınırlama elektron ışını ile radyasyon numuneye zarar verir. Bu, sadece çok düşük dozlarda elektron zayıf sinyal-t ile sonuçlanan bir tomografik eğim serinin her görüntüyü kaydetmek için kullanılan anlamına gelirO-gürültü sonuçta elde çözünürlüğünü sınırlar oranı. Bir yıl önce daha az piyasaya yeni doğrudan elektron dedektörleri, şu anda tek parçacık cryo-EM 44, 45 alanında devrim vardır. Bu yeni detektörler düşük elektron dozlarda daha yüksek kontrast ve daha iyi çözünürlük sağlar. Elektron cryo-tomografi için, bu aşırı radyasyon hasarı (bir CCD görüntü 5 doğrudan elektron dedektörü görüntüleri elektron dozunda eşdeğer) endişe olmadan alınabilir küçük adım boyutlarda hatta çift eksenli tomogramları ile Eğim dizi anlamına gelir. Bu dedektörler tarafından üretilen verilerin büyük miktarlarda üstesinden gerekecektir veri işleme, saklama ve işleme kendi zorlukları, oluşturun.
Buna ek olarak, faz kontrastı arttırmak için ışık mikroskobu rutin olarak kullanılanlar gibi benzer prensipler ile çalışır faz plakaları şu anda, transmisyon elektron mikroskopisi 46, 4 için geliştirilmektedir7. Bu tomografi odaklanmak yakın toplanmış ve dolayısıyla daha yüksek çözünürlükte, aynı zamanda düşük çözünürlüklü koruyarak uyum ve tomografik hacimleri yorumlanması için gerekli özellikleri izin vermelidir. Birlikte ele alındığında, bu teknolojik gelişmeler büyük ölçüde cryo-ET tarafından ele alınabilir biyolojik sorular yelpazesini genişletmek olacaktır.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Max Planck Kurumu (KMD, BD, AWM'nin, TB, TBB, DJM ve WK), Deutsche Forschungsgemeinschaft (WK) ve bir doktora sonrası EMBO Uzun Vadeli tarafından finanse Excellence Frankfurt "makromoleküler kompleksleri" bir Kümesi tarafından desteklenen Bursu (VAMG).
Sucrose | ROTH | 4621.2 | |
Trehalose | Sigma-Aldrich | T9449 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Zymolase | biomol | Z1000.1 | |
Density gradient medium | Sigma-Aldrich | D1556 or P1644 | |
Protein A gold | Aurion | 810.111 | 10 nm |
Ethane | Air Liquide | P0502S02R0A001 | |
Nitrogen | Air Liquide | I4150RG | |
Consumables | |||
Filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1004 090 | Nr 4 |
Tweezers | Dumont | T506 | Non-magnetic, pattern #5 |
EM combined test grid | Plano GmbH | S142 | grapite and gold islands on holey carbon film |
Holey carbon grids | Quantifoil Micro Tools GmbH or C-flat | R2/2 300 Cu mesh | |
Cryo grid boxes | Plano GmbH | 160-42 | Alternative home-made metal boxes |
Equipment | |||
Potter | Sigma-Aldrich | P7984 | |
Blender | Waring | 8011S | |
Glass bead mill – bead beater | BioSpec Products | 1107900-105 | Including 0.5 mm beads |
Ball-bearing (Balch) homogeniser | isobiotec | H8 | |
Centrifuge | Thermo Scientific | 46915 | Sorvall RC6+ |
Glow-discharge apparatus | Bal-Tec A.G. | CTA 010 | |
Grid vitrification device | FEI, Gatan or Leica | Alternative home-made plunger | |
Transmission electron microscope | FEI or Jeol | 300 keV | |
Direct electron detector (CMOS) | Gatan | 4k x 4k pixels, counted mode | |
Charge coupled device | Gatan | 4K x 4K pixels (alternative to Direct electron detector) | |
Energy filter | Gatan or Jeol | ||
Software | |||
Image acquisition software | Gatan | ||
Tomogram acquisition software | Gatan, FEI, USCF, or UC-Boulder | 4 alternatives | |
Tomogram processing software | FEI, UCSF or UC-Boulder | 3 alternatives | |
Subtomogram averaging software | UC-Boulder, or University of Basel | 2 alternatives | |
Tomogram visualisation software | UC-Boulder, FEI, or University of Utah | 3 alternatives | |
visualisation software plugin | Goethe university | http://www.biophys.uni-frankfurt.de/frangakis/ | |
Structure visualisation software | UCSF | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | |
Numerical calculation software | MathWorks | http://www.mathworks.de/academia/ |