En protokol er beskrevet som anvender anoksi / sult i C. elegans at modellere iskæmi / reperfusion. Funktionelle resultater omfatter øget dødelighed, synlige abnormiteter i GFP-mærkede neuronale processer og værdiforringede adfærdsmæssige reaktioner, der kræver neuronal funktion.
Protokoller for iltmangel / sult i den genetiske model organisme C. elegans simulere iskæmi / reperfusion. Orme er adskilt fra bakteriel fødevarer og anbragt under iltmangel i 20 timer (simuleret iskæmi) og efterfølgende flyttet til en normal atmosfære med mad (simuleret reperfusion). Denne eksperimentelle paradigme resulterer i forøget død og neuronal beskadigelse og teknikker er præsenteret for at vurdere organisme levedygtighed ændringer morfologi touch neuron processer samt berøringsfølsomhed, som repræsenterer den adfærdsmæssige produktion af neuronal funktion. Endelig er en metode til at konstruere hypoxisk væksthuse bruge fælles køkken opbevaringsbeholdere beskrevet. Tilføjelsen af en massestrøm styreenhed giver mulighed for ændringer, der skal foretages gasblandingen i de brugerdefinerede inkubatorer, og et cirkulerende vandbad giver mulighed for både temperaturkontrol og gør det nemt at identificere lækager. Denne metode giver en prisbilligt alternativ til kommercielttilgængelige enheder.
C. elegans er en rundorm, der er blevet bredt vedtaget som en flercellet eukaryot model organisme siden indførelsen af Brenner 1.. Det er en billig, enkel og alsidig model, der giver let forbindelser mellem genetiske ændringer og fænotypiske ændringer 2.
Iskæmi er kendetegnet ved en mangel på næringsstoffer og ilt til et væv, efterfulgt af reperfusion, når en byge af reaktive oxygenspecies er produceret 3 og det meste af skaden opstår. I 2002 blev en model af iskæmi / reperfusion (IR) i C. elegans blev udviklet 4 involverer indsendelse af hele ormen for iltmangel, næringsstof afsavn og varmestress i ca 20 timer efterfulgt af 24 timer under normale forhold. Selv om denne model er teknisk en anoxia-sult (AS) tilstand, der opstår celledød gennem mekanismer, der er bevaret i pattedyr, herunder skader fremkaldt af oxidanter under reperfusion <sup> 5.. Endvidere ligner pattedyr IR, beskadigelse induceret af AS i C. elegans kan forhindres ved iskæmisk prækonditionering 6,7 eller bedøvende prækonditionering 8,9.
Protokollerne nedenfor viser, hvordan at efterligne IR i C. elegans vha. AS-modellen, hvordan at score morfologiske og adfærdsmæssige abnormiteter, der skyldes AS, og hvordan man kan tilpasse protokollen på en måde, der gør det muligt for forsøget skal udføres med en lavere initial investering ved hjælp af et skræddersyet, let-bygget alternativ kammer .
AS har været meget anvendt i C. elegans til model IR skade. Nogle af de vigtigste punkter bør fremhæves for denne protokol: C. elegans er resistente over for en bred vifte af skader, der begrunder behovet for 3 samtidige fornærmelser (varme, sult og anoxi) for at opnå døden ved hjælp af dette system. Anoxia alene ikke dræbe orme i dette vindue af tid 14. Desuden temperaturstigning er en ekstra stress, så det er vigtigt at føre nøje tilsyn. Strengt taget, er sult ikke bidrage væsentligt til den grad af dødelighed observeret 7, per se, men det ser ud til at reducere variabilitet blandt eksperimentelle gentagelser. I betragtning af at der kan være betydelige variationer fra dag-til-dag, er det ekstremt vigtigt at sammenligne prøver køres direkte parallelt, og at gentage eksperimenter over flere dage. Generelt er resultaterne målt for tre særskilte plader 50-100 orme / eksperimentel betingelse og det er dissen gennemsnit og betragtes som en enkelt eksperimentel kopiere. Generelt mellem syv og ni gentagelser synes at være tilstrækkelig til at opnå eller udelukke statistisk signifikans.
Udviklingsstadium orme, der anvendes i forsøget skal også overvåges nøje, da modtagelighed forskellige stadier til AS skader varierer betydeligt 15,16. Anvendelsen af unge voksne er standard, og larvestadiet (L3 og L4) orme synes at være mere resistente over for de skadelige virkninger af AS (upublicerede data).
Denne protokol præsenterer to måder at udføre forsøgene, den ene med en lab-fremstillet apparat (ved hjælp af Tupperware-type containere og gas input 11) og andre ved hjælp af en kommerciel hypoxisk kammer 4,6. Anoxia kan opnås med andre midler, der forbruger ilten, som beskrevet andetsteds 13,17. Brugen af alternative teknikker til at skabe et hypoxisk miljø kan ændre AS inkubationstiden nødvendigfor at skabe den ønskede mængde af død. Målretning ~ 20% overlevelse er et ideelt udgangspunkt for at studere beskyttende indgreb, mens 80% er ligeledes ideel til interventioner, som forværrer de skadelige virkninger af AS. Et andet vigtigt forbehold er det tidspunkt, hvor observatøren scorer døde / levende orme. Hvis tid til analyse forlænges ud over 24 timer, kan dataene være misvisende, da døde orme bliver stadig vanskeligere at identificere. Dette kan skyldes orm kroppe blive relativt transparente over tid, men også det faktum, at befrugtede embryoner kan udvikle sig til afkom post mortem indersiden af slagtekroppe og forstyrre dem som de opstår.
Analysen af neuronal morfologi kan modificeres til at se på protein ekspressionsmønstre 18, nuklear fragmentering 4 og andre parametre 19 ved at substituere en orm stamme, der udtrykker den passende genetisk kodet markør. En sidste advarsel er, at visualiseringen afneuronale processer skal foregå mindre end 30 minutter efter at placere orme på diaset. Dyr, der holdes under anæstesi på dias i længere perioder kan udvise AS-uafhængig skader. Juster mængden af dyr pr slide i henhold til den nødvendige tid til at spore og analysere dem.
The authors have nothing to disclose.
Figur 1 og 2 er tidligere udgivet i Free Radical Biology & Medicine (Queliconi et al. 5), og har ophavsret ejes af Elsevier. Dette arbejde blev støttet af Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Processos Redox em Biomedicina, at Núcleo de Apoio à Pesquisa de Processos Redox em Biomedicina, USPHS NS064945 (KN), og USPHS GM087483 (KN ). BBQ er en ph.d.-studerende understøttes af en FAPESP fællesskab.
N2 strain | CGC (http://www.cbs.umn.edu/CGC/) | Wild type strain | |
TU2583 uIs25 (Pmec-18::GFP) | CGC (http://www.cbs.umn.edu/CGC/) | TU2583 | integrated fluorescent transgene used to label touch neurons |
CB1338 mec-3 (e1338)IV | CGC (http://www.cbs.umn.edu/CGC/) | CB1338 | canonical mec-3 mutant that is touch insensitive |
Microcentrifuge Tube | Eppendorf | 0030 120.086 | |
Nikon Eclipse TE2000-U Microscope | Nikon USA | TE2000-U | |
Low Temperature Incubator | Sheldon Manufacturing Inc. | Model 2005 | |
Eyelash Pick | An eyelash pick can be prepared by attaching an eyelash onto a wooden toothpick, then attaching the toothpick in a glass Pasteur pipette (Figure 3) | ||
Hypoxic Chamber | Coy | 8307030 | Hypoxic Glove box equipped with paladium catalyst and CO2 controller. |