Ett protokoll beskrivs som använder syrebrist / svält i C. elegans att modellera ischemi / reperfusion. Funktionella resultat är ökad dödlighet, synliga avvikelser i GFP-märkta neuronala processer, och nedsatt beteendemässiga reaktioner som kräver neuronal funktion.
Protokoll för syrebrist / svält i genetisk modell organism C. elegans simulera ischemi / reperfusion. Maskar är separerade från bakteriell mat och placeras under syrebrist i 20 timmar (simulerad ischemi), och därefter flyttat till en normal atmosfär med mat (simulerad reperfusion). Denna experimentella paradigm leder till ökad död-och nervskador, och tekniker presenteras för att bedöma organismen livskraft, förändringar av morfologi av beröring neuron processer, samt anslagskänslighet, som representerar beteende produktionen av neuronal funktion. Slutligen är en metod för att konstruera hypoxiska inkubatorer i behållare, kök gemensamt lagrings beskrivas. Tillsatsen av en flödesreglermassenhet tillåter ändringar som skall göras i gasblandningen i de anpassade inkubatorer och ett cirkulerande vattenbad möjliggör både temperaturkontroll och gör det enkelt att identifiera läckor. Denna metod ger ett billigt alternativ till kommersiellatillgängliga enheter.
C. elegans är en nematod som har fått stor spridning som en flercellig eukaryot modellorganism sedan introduktionen av Brenner 1. Det är en billig, enkel och mångsidig modell, som möjliggör enkla kopplingar mellan genetiska förändringar och fenotypiska förändringar 2.
Ischemi kännetecknas av en brist på näringsämnen och syretillförseln till en vävnad, följt av reperfusion, när en skur av reaktiva syrespecies produceras 3 och de flesta av de skador som uppstår. År 2002, en modell av ischemi / reperfusion (IR) i C. elegans utvecklades 4 som innebär att lämna in hela masken till syrebrist, näringsämnen deprivation och värmestress för cirka 20 timmar följt av 24 timmar under normala förhållanden. Även denna modell är tekniskt en syrebrist-svält (AS) tillstånd, uppstår celldöd genom mekanismer som är bevarade i däggdjur, inklusive skador orsakade av oxidanter under reperfusion <sup> 5. Vidare liknar däggdjurs IR, skada inducerad av AS i C. elegans kan förhindras genom ischemisk prekonditionering 6,7 eller bedövningsmedel preconditioning 8,9.
Protokollen nedan visar hur man efterlikna IR i C. elegans med hjälp av AS-modellen, hur man gör mål morfologiska och beteendeavvikelser som beror på AS, och hur man anpassar protokollet på ett sätt som gör att försöket skall genomföras med en lägre initial investering med hjälp av en skräddarsydd, lätt-konstruerad kammar alternativ .
AS har använts i stor utsträckning i C. elegans att modellera IR skada. Några viktiga punkter bör betonas att detta protokoll: C. elegans är resistenta mot ett brett spektrum av skador, som motiverar behovet av 3 samtidiga förolämpningar (värme, svält och anoxi) för att åstadkomma död med hjälp av detta system. Anoxi ensam inte döda maskar i detta tidsfönster 14. Vidare är temperaturhöjningen en ytterligare stress, så det är viktigt att noggrant övervaka. Strängt taget innebär svält inte signifikant bidrar till graden av mortalitet 7, per se, men det verkar att minska variationen bland experimentella replikat. Med tanke på att det kan finnas betydande variation från dag till dag, är det oerhört viktigt att jämföra prover körs direkt parallellt, och att upprepa experiment över flera dagar. I allmänhet är resultaten mäts för tre separata plattor av 50-100 maskar / experimentell skick och det är den genomsnitt och betraktas som en enda experimentell replikera. Generellt, mellan sju och nio replikat verkar vara tillräckligt för att uppnå eller utesluta statistisk signifikans.
Utvecklingsstadiet av maskarna som används i experimentet måste också följas noggrant eftersom känsligheten för olika stadier till AS skador varierar kraftigt 15,16. Användningen av unga vuxna är standard, och larvstadiet (L3 och L4) maskar verkar vara mer motståndskraftiga mot de skadliga effekterna av AS (opublicerade data).
Detta protokoll utgör två sätt att utföra experiment, en med en lab-made apparater (med Tupperware-typ behållare och gas ingång 11) och andra med hjälp av en kommersiell hypoxisk kammare 4,6. Syrebrist kan uppnås med andra medel som förbrukar syre, som beskrivs på annan plats 13,17. Användningen av alternativa metoder för att skapa en hypoxisk miljö kan förändra AS inkubationstid nödvändigför att skapa den önskade mängden dödsfall. Inriktning ~ 20% överlevnad är en idealisk utgångspunkt för att studera skyddsinsatser, medan 80% är lika perfekt för interventioner som förvärrar de skadliga effekterna av AS. Ett annat viktigt förbehåll är den tid vid vilken observatören tjog döda / levande maskar. Om tiden för analysen förlängas efter 24 timmar, kan uppgifterna vara missvisande eftersom döda maskar blivit allt svårare att identifiera. Detta kan bero på masken slaktkroppar blir relativt transparent över tid, men också på det faktum att befruktade embryon kan utvecklas till avkomma efter slakt insidan av slaktkroppar och störa dem när de dyker upp.
Analysen av neuronal morfologi kan modifieras för att titta på proteinuttrycksmönster 18, nukleär fragmentation 4 och andra parametrar 19 genom substitution av en mask-stam som uttrycker den lämpliga genetiskt kodad markör. En sista varning är att visualisering avneuronala processerna bör göras mindre än 30 minuter efter att placera maskarna på bilden. Djuren hålls under narkos på diabilder under längre perioder kan uppvisa AS oberoende skador. Justera mängden djur per slide efter den tid som behövs för att spåra och analysera dem.
The authors have nothing to disclose.
Figurerna 1 och 2 har tidigare publicerats i Free Radical Biology & Medicine (Queliconi et al. 5) och har upphovsrätt innehas av Elsevier. Detta arbete stöddes av Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Processos Redox em Biomedicina, den Núcleo de Apoio à Pesquisa de Processos Redox em Biomedicina, USPHS NS064945 (KN), och USPHS GM087483 (KN ). BBQ är en doktorand med stöd av en FAPESP gemenskap.
N2 strain | CGC (http://www.cbs.umn.edu/CGC/) | Wild type strain | |
TU2583 uIs25 (Pmec-18::GFP) | CGC (http://www.cbs.umn.edu/CGC/) | TU2583 | integrated fluorescent transgene used to label touch neurons |
CB1338 mec-3 (e1338)IV | CGC (http://www.cbs.umn.edu/CGC/) | CB1338 | canonical mec-3 mutant that is touch insensitive |
Microcentrifuge Tube | Eppendorf | 0030 120.086 | |
Nikon Eclipse TE2000-U Microscope | Nikon USA | TE2000-U | |
Low Temperature Incubator | Sheldon Manufacturing Inc. | Model 2005 | |
Eyelash Pick | An eyelash pick can be prepared by attaching an eyelash onto a wooden toothpick, then attaching the toothpick in a glass Pasteur pipette (Figure 3) | ||
Hypoxic Chamber | Coy | 8307030 | Hypoxic Glove box equipped with paladium catalyst and CO2 controller. |