Imaging attraverso il caso pupa di<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
Questo documento dimostra l'uso di una scansione rapida microscopio confocale a comportamenti cella di immagine direttamente attraverso il puparium. Lasciando il bozzolo intatto, questo metodo permette l'osservazione e la misurazione dei processi cellulari dinamiche in una fase di sviluppo Drosophila che è difficile da studiare direttamente.
Abstract
L'uso di lunga data di Drosophila come modello per la biologia cellulare e dello sviluppo ha prodotto una serie di strumenti. Insieme, queste tecniche hanno permesso l'analisi di biologia cellulare e dello sviluppo da diverse angolazioni metodologiche. L'imaging dal vivo è un metodo emergente per osservare processi cellulari dinamici, come la divisione cellulare e la motilità cellulare. Avendo mutazioni isolato in non caratterizzate proteine del ciclo cellulare putative divenne essenziale osservare mitosi in situ utilizzando l'imaging dal vivo. La maggior parte degli studi di imaging dal vivo in Drosophila sono concentrati sulle fasi embrionali che sono accessibili alla manipolazione e l'osservazione a causa delle loro piccole dimensioni e chiarezza ottica. Tuttavia, in queste fasi del ciclo cellulare è insolito in quanto manca di una o entrambe le fasi gap. Per contro, le cellule dell'ala pupa di Drosophila hanno un ciclo tipica cellula e sottoposti ad un periodo di rapida mitosi attraversa circa 20 ore di sviluppo pupa. È facile identify e isolare pupe della fase di catturare mitosi in situ. Montaggio pupe intatta disponibile la migliore combinazione di trattabilità e durata durante l'imaging, consentendo di eseguire esperimenti per diverse ore con un impatto minimo sulla vitalità cellulare e animale. Il metodo permette l'osservazione di caratteristiche più piccolo, o minore di, volare cromosomi. Regolazione delle impostazioni del microscopio e dei dettagli del montaggio, ha consentito l'estensione della preparazione per la visualizzazione dinamica della membrana delle cellule adiacenti e proteine fluorescente come la tubulina. Questo metodo funziona per tutte le proteine fluorescenti testate e in grado di catturare le caratteristiche di scala inferiori al micron su una varietà di scale temporali. Mentre limitato al esterno 20 micron della pupa con un microscopio confocale convenzionale, questo approccio all'osservazione proteine e dinamiche cellulari nei tessuti pupa in vivo può essere generalmente utile nello studio della biologia cellulare e dello sviluppo in questi tessuti.
Introduction
La mosca dell'aceto, Drosophila melanogaster, è un modello affermato per studiare molti aspetti della biologia. Ricerca Drosophila ha una storia ricca di sperimentazione genetica che permette forme sofisticate di manipolazione genetica, tra cui l'espressione, l'abbattimento e la mutazione. Con l'avvento delle etichette proteine fluorescenti, questo repertorio si è ampliato per includere studi sulle cellule e proteine in animali vivi. L'embrione mosca è un ottimo sistema per tali studi è piccolo e otticamente trasparente permettendo profondo, immagini ad alta risoluzione in vivo 1-3. Altri stadi di sviluppo mosca hanno dimostrato di essere meno trattabili, che richiedono l'anestesia 4, la dissezione e la cultura a breve termine 5,6, o la creazione di finestre nella cuticola per l'imaging 7,8. Queste manipolazioni solito compromettono sviluppo animale a lungo termine o influenzano l'animale in modo che limitano imaging per brevi periodi.
ent "> Per studiare nuove mutazioni in geni che assomigliano regolatori del ciclo cellulare, era essenziale trovare un'adeguata preparazione per studiare la sincronizzazione e la fedeltà del ciclo cellulare. Poiché la maggior parte cicli cellulari embrionali sono troncati (SM o S-G2-M) e mutanti in studio non mostrano difetti fino fasi successive, era importante osservare il ciclo cellulare nei tessuti stadio di pupa. delle cellule epiteliali della pupa hanno un più tipico ciclo cellulare G1-S-G2-M e pupe di questa fase sono non capace di movimenti muscolari 9. Il punto di partenza iniziale per manipolazioni inclusa intatta tutta pupe esprimere Histone2AV-GFP. Nonostante l'apparente opacità del bozzolo, questa preparazione intatta rivelata eccellente per lungo termine imaging in vivo. Questa tecnica è semplice basta che i ricercatori universitari abitualmente usano per studiare gli aspetti di biologia cellulare e dello sviluppo in Drosophila, eppure la risoluzione è abbastanza fine per consentire la discriminazione delle caratteristiche scala micrometrica. Con questo metodo, le osservazioni degli eventi più ore, minuti o secondi sono possibili semplicemente regolando i parametri di serie temporali. Video che utilizzano proteine, verde, giallo, arancio, rosso e blu fluorescenti, o combinazioni di questi, sono stati fatti. È importante sottolineare che, se si fa attenzione a ridurre al minimo l'intensità del laser, anche di imaging a lungo termine non ha alcun effetto sullo sviluppo o la vitalità degli animali.Protocol
Representative Results
Discussion
Per visualizzare, misurare e quantificare le caratteristiche delle cellule in divisione, lo sviluppo necessario di una semplice preparazione per osservare mitosi nell'ala pupa vivente di Drosophila mediante analisi confocale di His2AvGFP cellule che esprimono. Questo metodo è stato usato per documentare che il ciclo cellulare nell'ala pupa somiglianze forti alla cella cicli in epiteli pseudostratificato dal fatto che nuclei mossa alla superficie apicale dell'epitelio cui entrano mitosi. Dopo telofa…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Akira Chiba per il sostegno intellettuale, supporto materiale, e le scorte. Grazie a Julia Dallman per i commenti.
Materials
| Fly stuff fly pad | Genesee scientific | 59-114 | for fly anesthetization |
| CO2 gas | Airgas south | CD50 | For fly anesthetization |
| Regulator | Airgas south | CO2 regulator | |
| Fly vials | Genesee scientific | 32-113RLBF | Fly culture |
| Drosophila lines:A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773) | Bloomington Stock center | ||
| Glass bottom dishes #1 1/2 | WillCo Wells BV | For microscopy | |
| Thiodiethylene Glycol | Fluka | 88559 | mountant |
| Modeling clay | art supply store | Support to position pupae against | |
| Paintbrushes | art supply store | To manipulate flies | |
| Fine Forceps, Inox #5 | Fine science tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| computer | any | 8 Gb RAM for image/movie analysis | |
| Fiji software | Free ware http://fiji.sc/Fiji | Image analysis software | |
| Confocal microscope | Any fast scanning confocal should be sufficient | ||
| 20x dry, and 40x or 63x oil immersion lenses | any | For imaging tissue, cellular and subcellular features | |
| Immersion oil (non fluorescent) | |||
| Stereo microscope | any | For fly manipulation |
Riferimenti
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