Isolering og dyrkning af Dental Epiteliale stamceller fra voksne mus Fortand
Summary
Den stadigt voksende mus fortand indeholder en model for at studere fornyelse af dental væv fra dental epitelial stamceller (DESCs). Et robust system til konsekvent og pålideligt at få disse celler fra fortand og udvide dem in vitro er rapporteret her.
Abstract
Forståelse af de cellulære og molekylære mekanismer, der ligger til grund for tand regenerering og fornyelse er blevet et emne af stor interesse 1-4, og musen fortand en model for disse processer. Denne bemærkelsesværdige orgel vokser løbende i hele dyrets liv og genererer alle nødvendige celletyper fra aktive puljer af voksne stamceller huse i labial (mod kant) og flersprogede (mod tungen) livmoderhalskræft løkke (CL) regioner. Kun de dentale stamceller fra labial CL giver anledning til ameloblaster som genererer emalje, det ydre dække af tænder på labial overflade. Denne asymmetriske emalje dannelse giver slid på fortand spids, og stamfædre og stamceller i den proksimale fortand sikre, at de dental væv konstant genopfyldes. Evnen til at isolere og dyrke disse progenitor eller stamceller in vitro giver deres ekspansion og åbner dørene til en lang række forsøg, der ikke kan opnås in vivo, såsom hIGH throughput test af potentielle stamceller regulatoriske faktorer. Her beskriver vi, og udviser en pålidelig og konsekvent metode til at dyrke celler fra labial CL musen fortand.
Introduction
Et af de unikke egenskaber hos hvirveldyr er udviklingen af tænder. Tanden er blevet en vigtig model for mange forskningsområder, som de molekylære veje og morfologiske specialer er relevante for dette organ er blevet undersøgt fra flere perspektiver, herunder ved udviklingsmæssige og evolutionære biologer 5. Mere for nylig, har inden for regenerativ medicin begyndt at få værdifuld indsigt ved hjælp af tanden som model. Navnlig har opdagelsen af dentale epitel stamceller været et vigtigt fremskridt 6-13.
Alle gnavere besidder konstant voksende fortænder, hvis vækst er drevet af stamceller, hvilket gør disse tænder et tilgængeligt modelsystem til at studere voksne stamceller regulering. Mærkningsordninger eksperimenter i 1970'erne 10,11, efterfulgt af genetisk afstamning tracing eksperimenter 8,9,12,14, har påvist, at DESCs opholde sig i den proksimale region i fortand. Stilkencelle afkom i epithelial rum på labial side flytte ud af den formodede niche, kendt som labial livmoderhalskræft sløjfe (CL), og bidrage til en population af celler, der kaldes transit-uddybning (TA)-celler (figur 1). Konkret DESCs opholde sig i den ydre emalje epitel (OEE) og stellate reticulum (SR) 8,9,14, og den indvendige emalje epitel (IEE) giver anledning til TA celler, fremskridt gennem et begrænset antal cellecykler og derefter flytte distalt langs længden af fortand (figur 1). De differentierende ameloblasts i musen fortand fortsætter med at bevæge sig distalt langs fortand på en bemærkelsesværdig hastighed på ca 350 um i en enkelt dag 15,16. Som de bevæger sig, cellerne differentiere til modne ameloblasts og stratum intermedium (SI) celler. Efter deponeringen af fulde tykkelse emaljematrix, mange af de ameloblasts undergå apoptose, og de resterende celler skrumpe i størrelse og regulere emalje modning <sup> 17.. Slægt af andre celletyper i læbe CL, som SR, er mindre klar, og data vedrørende stamceller i mesenkymet 18 og i flersprogede CL er kun lige begyndt at dukke op.
Brug musen til fortand model, har en række grupper arbejdet med at belyse de genetiske veje og cellebiologiske processer involveret i naturlig stamcelle-baserede orgel fornyelse. Men den labial CL indeholder et relativt lille antal celler, der anslås at være omkring 5.000 pr mus fortand, hvilket gør arbejdet med primære celler udfordrende. Derfor har man gjort en indsats for kultur og udbygge disse celler in vitro 6,16,19,20 for at åbne nye døre til eksperimentelle metoder, som ikke er opnåelige in vivo. Den seneste undersøgelse har vist, at disse celler kan både selv-forny og differentiere i amelogenin udtrykker celler, når de dyrkes 13. Her beskriver vi, og udviser en fremgangsmåde til the pålidelig og konsistent kultur af celler fra mus labial CL.
Protocol
Representative Results
Discussion
Epitelceller var først med held dyrket over 40 år siden 21-24, og for nylig har vellykket isolering af epitelceller stamceller 25-27 avancerede vores viden om epitelial biologi. Vi rapporterer en protokol til isolering af DESCs af den voksne mus fortand en relativt understudied population af stamceller, der har potentialet til at give et vigtigt indblik i dental biologi og emalje formation. Denne protokol var oprindeligt baseret på tidligere undersøgelser af epitelial stamceller isolation fra h…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Xiu-Ping Wang til indledende hjælp med DESC kulturer. Forfatterne er finansieret delvist af stipendier og tilskud fra National Institutes of Health (K99-DE022059 til AHJ, K12-GM081266 til MGC, K08-DE022377-02 til OH og R01-DE021420 til ODK).
Materials
| Forceps, size 5 | Fine Science Tools | 11251-30 | FST by Dumont, Dumoxel, |
| Forceps Straight, fine, 3.5 | Roboz | RS5070 | |
| Razorblades | Electron Microscopy Services | #71960 | |
| Scalpel Handle No.3 | VWR | ||
| Feather Blade No. 15 | Electron Microscopy Services | #72044-15 | Surgical Stainless Steel |
| Collagenase Type-1 filtered | Worthington Biochemical Corporation | #4214 | |
| Insulin syringe | BD | #329424 | |
| Accumax | EMD Millipore | #SCR006 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | |
| EGF | R&D | 2028-EG-200 | |
| FGF2 | R&D | 233-FB-025 | |
| B27 Supplement | Gibco | 10889-038 |
Riferimenti
- Sharpe, P. T., Young, C. S. Test-tube teeth.. Sci Am. 293, 34-41 (2005).
- D’Souza, R. N., Klein, O. D. Unraveling the molecular mechanisms that lead to supernumerary teeth in mice and men: Current concepts and novel approaches. Cells Tissues Organs. 186, 60-69 (2007).
- Jernvall, J., Thesleff, I. Tooth shape formation and tooth renewal: evolving with the same signals. Development. 139, 3487-3497 (2012).
- Yen, A. H., Yelick, P. C. Dental Tissue Regeneration A Mini-Review. Gerontology. 57, 85-94 (2011).
- Jheon, A. H., Seidel, K., Biehs, B., Klein, O. D. From molecules to mastication: the development and evolution of tooth development. WIREs Dev Biol. 2, 165-182 (2013).
- Wang, X. P., et al. An integrated gene regulatory network controls stem cell proliferation in teeth. PLoS Biol. 5, (2007).
- Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. J Cell Biol. 147, 105-120 (1999).
- Juuri, E., et al. Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors. Dev Cell. 23, 317-328 (2012).
- Seidel, K., et al. Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor. Development. 137, 3753-3761 (2010).
- Smith, C. E., Warshawsky, H. Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine. Anat Rec. 183, 523-561 (1975).
- Smith, C. E., Warshawsky, H. Quantitative analysis of cell turnover in the enamel organ of the rat incisor. Evidence for ameloblast death immediately after enamel matrix secretion. Anat Rec. 187, 63-98 (1977).
- Parsa, S., et al. Signaling by FGFR2b controls the regenerative capacity of adult mouse incisors. Development. 137, 3743-3752 (2010).
- Chang, J. Y., et al. Self-renewal and multilineage differentiation of mouse dental epithelial stem cells. Stem Cell Res. 11, 990-1002 (2013).
- Biehs, B., et al. Bmi1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor. Nat Cell Biol. 15, 846-852 (2013).
- Hwang, W. S., Tonna, E. A. Autoradiographic Analysis of Labeling Indices and Migration Rates of Cellular Component of Mouse Incisors Using Tritiated Thymidine (H3tdr). J Dent Res. 44, 42-53 (1965).
- Li, C. Y., et al. E-cadherin regulates the behavior and fate of epithelial stem cells and their progeny in the mouse incisor. Dev Biol. 366, 357-366 (2012).
- Smith, C. E. Cellular and chemical events during enamel maturation. Crit Rev Oral Biol Med. 9, 128-161 (1998).
- Lapthanasupkul, P., et al. Ring1a/b polycomb proteins regulate the mesenchymal stem cell niche in continuously growing incisors. Dev Biol. 367, 140-153 (2012).
- Chavez, M. G., et al. Characterization of dental epithelial stem cells from the mouse incisor with two-dimensional and three-dimensional platforms. Tissue Eng Part C Methods. 19, 15-24 (2013).
- Kawano, S., et al. Establishment of dental epithelial cell line (HAT-7) and the cell differentiation dependent on Notch signaling pathway. Connect Tissue Res. 43, 409-412 (2002).
- Briggaman, R. A., Abele, D. C., Harris, S. R., Wheeler, C. E. Preparation and characterization of a viable suspension of postembryonic human epidermal cells. J Invest Dermatol. 48, 159-168 (1967).
- Fusenig, N. E. Isolation and cultivation of epidermal cells from embryonic mouse skin. Naturwissenschaften. 58, 421 (1971).
- Fusenig, N. E., Worst, P. K. Mouse epidermal cell cultures. I. Isolation and cultivation of epidermal cells from adult mouse skin. J Invest Dermatol. 63, 187-193 (1974).
- Rheinwald, J. G., Green, H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell. 6, 331-343 (1975).
- Barrandon, Y., Green, H. Three clonal types of keratinocyte with different capacities for multiplication. Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 2302-2306 (1987).
- Blanpain, C., et al. Self-renewal, multipotency, and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche. Cell. 118, 635-648 (2004).
- Toma, J. G., et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat Cell Biol. 3, 778-784 (2001).
- Nowak, J. A., Fuchs, E. Isolation and culture of epithelial stem cells. Methods Mol Biol. 482, 215-232 (2009).
- Rheinwald, J. G., Green, H. Epidermal growth factor and the multiplication of cultured human epidermal keratinocytes. Nature. 265, 421-424 (1977).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
- Lesuisse, C., Martin, L. J. Long-term culture of mouse cortical neurons as a model for neuronal development, aging, and death. J Neurobiol. 51, 9-23 (2002).
- Felszeghy, S., Suomalainen, M., Thesleff, I. Notch signalling is required for the survival of epithelial stem cells in the continuously growing mouse incisor. Differentiation. 80, 241-248 (2010).
- Fujimori, S., et al. Wnt/beta-catenin signaling in the dental mesenchyme regulates incisor development by regulating Bmp4. Dev Biol. 348, 97-106 (2010).
- Klein, O. D., et al. An FGF signaling loop sustains the generation of differentiated progeny from stem cells in mouse incisors. Development. 135, 377-385 (2008).
