Isolasjon og kultur av Dental Epiteliale stamceller fra voksne musen Fortann

Summary

Den stadig voksende mus fortann gir en modell for å studere fornyelse av tannvev fra dental epitel stamceller (DESCs). Et robust system for konsekvent og pålitelig måte å skaffe disse cellene fra fortann og utvide dem in vitro er rapportert her.

Abstract

Forstå de cellulære og molekylære mekanismer som ligger til grunn tann gjenfødelse og fornyelse har blitt et tema av stor interesse ^1-4, og musen fortann gir en modell for disse prosessene. Denne bemerkelsesverdige organ vokser kontinuerlig gjennom hele dyrets levetid og genererer alle nødvendige celletyper fra aktive bassenger av voksne stamceller plassert i labial (mot leppe) og språklige (mot tungen) livmorhals sløyfe (CL) regioner. Bare de dentale stamceller fra den labiale CL gi opphav til ameloblaster som genererer emalje, den ytre tildekning av tenner, på den labiale overflate. Denne asymmetriske emalje dannelse gjør slitasje på fortann spissen, og stamfedre og stamceller i den proksimale fortann sikre at tannvev er stadig etterfylles. Evnen til å isolere og dyrke disse progenitor-eller stamceller in vitro tillater deres utvidelse og åpner dørene til en rekke eksperimenter ikke oppnåelige in vivo, som for eksempel tigh gjennomstrømming testing av potensielle stamcelle regulatoriske forhold. Her beskriver vi og demonstrere en pålitelig og konsistent metode for å dyrke celler fra labial CL av musen fortann.

Introduction

En av de unike egenskapene til virveldyr er utviklingen av tennene. Tannen har blitt en viktig modell for mange forskningsområder, som de molekylære stier og morfologiske spesialiseringer er relevante for dette organet er blitt undersøkt fra flere perspektiver, blant annet ved utviklings-og evolusjonsbiologer ^fem. Mer nylig har innen regenerativ medisin begynt å få verdifull innsikt ved hjelp av tannen som modell. Spesielt har oppdagelsen av tann epitelial stamceller vært et viktig fremskritt ^6-13.

Alle gnagere har kontinuerlig voksende fortenner som veksten er drevet av stamceller, noe som gjør disse tennene et tilgjengelig modellsystem for å studere voksen stamcelle regulering. Merking eksperimenter i 1970 ^10,11, etterfulgt av genetisk avstamning tracing eksperimenter ^8,9,12,14, har vist at DESCs bor i proksimale regionen av fortann. Stammencelleavkom i det epiteliale rom i labial side bevegelse ut av det putative nisje, kjent som den labiale cervical sløyfe (CL), og bidrar til en populasjon av celler som kalles transitt-amplifisering (TA)-celler (figur 1). Spesielt DESCs bor i ytre emalje epitel (OEE) og stel retikulum (SR) ^8,9,14, og den indre emalje epitel (IEE) gir opphav til TA celler som fremgang gjennom et begrenset antall cellesykluser og deretter flytte distalt langs lengden av fortann (figur 1). De forskjellige ameloblaster i muse fortann fortsette å bevege seg distalt langs fortann på en bemerkelsesverdig rate på ca 350 mikrometer i en enkelt dag ^15,16. Som de beveger seg, cellene differensieres til modne ameloblaster og stratum overgangsledder (SI) celler. Etter deponeringen av den fulle tykkelse av emaljen matrise, er mange av ameloblaster gjennomgår apoptose, og de gjenværende celler krympe i størrelse og regulere emalje modning <sup> 17. Avstamning av de andre celletyper i labial CL, slik som SR, er mindre klart, og data om stamceller i mesenchyme ¹⁸ og i den språklige CL er bare begynner å dukke opp.

Ved hjelp av musen fortann modell, har en rekke grupper jobbet med å belyse de genetiske trasé og cellebiologiske prosesser involvert i naturlig stamcellebaserte organ fornyelse. Imidlertid inneholder den labial CL et relativt lite antall celler, anslått til å være ca 5000 per mus fortann, som gjør arbeidet med primære celler utfordrende. Derfor har det vært gjort for å kultur og ekspandere disse cellene in vitro ^6,16,19,20 for å åpne nye dører til eksperimentelle tilnærminger som ikke er oppnåelige in vivo. Den siste studien har vist at disse cellene kan både selv fornye og differensiere i amelogenin uttrykke celler når kultivert ^13. Her beskriver vi og demonstrere en metode for the pålitelig og konsistent kultur av celler fra muse labial CL.

Protocol

En. Dissekere Lavere Hemi-kjever fra Adult Mouse Før du utfører denne protokollen, innhente nødvendig institusjonell godkjenning og sørg for å overholde alle retningslinjer dyr omsorg. Avlive dyret ved hjelp av standard IACUC godkjente prosedyrer. For dette arbeidet CO 2 kvelning ble anvendt fulgt av cervical dislokasjon. EKSTRA: Separat hodet fra resten av kroppen ved hjelp av et barberblad. Fjern skinnet fra underleppen til halsen. Ved hjelp av en skalp…

Representative Results

Musen hemi-kjeven består av en stadig voksende fortann og tre forankret jekslene (Figur 1a). Alle tennene består av dentin og emalje, de to mineralisert komponentene i tannkronen (figurene 1A og 1 A '). De fortann huser to stamcelle nisjer kalt labial CL og språklige CL, og emalje er dannet utelukkende på labial side (Figur 1A '). DESCs er ansvarlig for fortann emalje dannelse og er plassert i den labial CL, spesielt OEE og SR (Figur…

Discussion

Epitelceller var første hell kultivert over 40 år siden ^21-24, og mer nylig, har vellykket isolering av epiteliale stamceller ^25-27 utvidet vår kunnskap om epithelial biologi. Vi rapporterer en protokoll for å isolere DESCs av den voksne mus fortann, et relativt lite studert populasjon av stamceller som har potensial til å gi viktig innsikt i tann biologi og emalje formasjon. Denne protokollen ble opprinnelig basert på tidligere rapporter om epitel stamcelle isolasjon fra hårsekken ^28.<…

Materials

Forceps, size 5	Fine Science Tools	11251-30	FST by Dumont, Dumoxel,
Forceps Straight, fine, 3.5	Roboz	RS5070
Razorblades	Electron Microscopy Services	#71960
Scalpel Handle No.3	VWR
Feather Blade No. 15	Electron Microscopy Services	#72044-15	Surgical Stainless Steel
Collagenase Type-1 filtered	Worthington Biochemical Corporation	#4214
Insulin syringe	BD	#329424
Accumax	EMD Millipore	#SCR006
DMEM/F12	Gibco	11320-033
EGF	R&D	2028-EG-200
FGF2	R&D	233-FB-025
B27 Supplement	Gibco	10889-038