Isolering och kultur av Dental epitelceller stamceller från vuxen mus Incisor
Summary
Den ständigt växande musen framtand ger en modell för att studera förnyelse av tandvävnad från tand epitelceller stamceller (DESCs). Ett robust system för konsekvent och tillförlitligt sätt att få dessa celler från framtand och expandera dem in vitro redovisas här.
Abstract
Att förstå de cellulära och molekylära mekanismer som ligger bakom tand förnyelse och förnyelse har blivit ett ämne av stort intresse 1-4, och musen framtand ger en modell för dessa processer. Denna märkliga organ växer kontinuerligt under hela djurets liv och genererar alla nödvändiga celltyper från aktiva pooler av vuxna stamceller inrymt i labial (mot läppen) och lingual (mot tungan) livmoderhalscancer slinga (CL) regioner. Endast de dentala stamceller från den labiala CL medföra ameloblasts som genererar emalj, det yttersta skiktet på tänder, å labiala ytan. Denna asymmetriska emaljbildning tillåter nötning hos framtand spets, och ursprungsceller och stamceller i det proximala framtand säkerställa att de dentala vävnader ständigt fyllas. Förmågan att isolera och odla dessa progenitorceller eller stamceller in vitro gör sin expansion och öppnar dörrar till många försök som inte uppnås in vivo, till exempel hög genomströmning testning av potentiella stamcells reglerande faktorer. Här beskriver vi och demonstrera en tillförlitlig och konsekvent metod för att odla celler från läpp CL av musen framtand.
Introduction
En av de unika egenskaperna hos ryggradsdjur är utvecklingen av tänder. Tanden har blivit en viktig systemmodell för många forskningsområden, eftersom de molekylära vägar och morfologiska inriktningar relevanta för detta organ har undersökts ur flera perspektiv, bland annat genom utvecklings-och evolutionsbiologer 5. På senare tid har området för regenerativ medicin börjat få värdefulla insikter med hjälp av tanden som modell. Framför allt har upptäckten av dentala epitelceller stamceller varit ett viktigt framsteg 6-13.
Alla gnagare besitter ständigt växande framtänder vars tillväxt drivs av stamceller, vilket gör dessa tänder ett tillgängligt modellsystem för att studera vuxna stamceller reglering. Märkningsförsök i 1970-talet 10,11, följt av genetisk härstamning spåra experiment 8,9,12,14, har visat att DESCs bor i den proximala regionen av framtand. Skaftetcell avkomma i epitel facket på labial sidan flytta ut ur den förmodade nisch, känd som den labial livmoderhalscancer slingan (CL), samt bidra till en population av celler som kallas transit-förstärkning (TA)-celler (Figur 1). Specifikt DESCs bor i den yttre emalj epitel (OEE) och stellate reticulum (SR) 8,9,14, och den inre emalj epitel (IEE) ger upphov till TA celler som framsteg genom ett begränsat antal cellcykler och sedan flytta distalt utmed längden av den framtand (Figur 1). Differentierings ameloblasts i musen framtand fortsätta att röra sig distalt utmed framtand i en anmärkningsvärd hastighet av ca 350 ^ m på en enda dag 15,16. När de rör sig, cellerna differentieras till mogna ameloblasts och stratum och övergångs (SI) celler. Efter avsättning av hela tjockleken för emaljmatris, många av de ameloblasts genomgå apoptos, och de kvarvarande cellerna krympa i storlek och reglera emalj maturation <sup> 17. Den linjen av de andra celltyper i labial CL, till exempel SR, är mindre tydlig, och uppgifter om stamcellerna i mesenkymet 18 och i lingual CL bara börjat växa fram.
Använda musen framtand modellen, har ett antal grupper arbetat med att belysa de genetiska vägar och cellbiologiska processer i naturliga stamcellsbaserad förnyelse orgel. Däremot innehåller den labial CL ett relativt litet antal celler, uppskattas till cirka 5.000 per mus framtand, vilket gör arbetet med primära celler utmanande. Därför har ansträngningar gjorts för att kultur och utöka dessa celler in vitro 6,16,19,20 för att öppna nya dörrar för experimentella metoder som inte uppnås in vivo. Den senaste undersökningen har visat att dessa celler kan både själv-förnya och differentiera till amelogenin uttryckande celler vid odling 13. Här beskriver vi och demonstrera en metod för the tillförlitlig och konsekvent odling av celler från mus labial CL.
Protocol
Representative Results
Discussion
Epitelceller var först framgångsrikt odlade över 40 år sedan 21-24, och på senare tid, har framgångsrikt isolering av epitelceller stamceller 25-27 fram vår kunskap om epitelial biologi. Vi redovisar ett protokoll för att isolera DESCs av den vuxna musen framtand, en relativt understudied population av stamceller som har potential att ge viktiga insikter i tand biologi och emaljbildning. Detta protokoll var ursprungligen baserad på tidigare rapporter från epitelceller stamceller isolering…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Xiu-Ping Wang för inledande hjälp med DESC kulturer. Författarna finansieras delvis genom stipendier och bidrag från National Institutes of Health (K99-DE022059 till AHJ, K12-GM081266 till MGC, K08-DE022377-02 till OH och R01-DE021420 till ODK).
Materials
| Forceps, size 5 | Fine Science Tools | 11251-30 | FST by Dumont, Dumoxel, |
| Forceps Straight, fine, 3.5 | Roboz | RS5070 | |
| Razorblades | Electron Microscopy Services | #71960 | |
| Scalpel Handle No.3 | VWR | ||
| Feather Blade No. 15 | Electron Microscopy Services | #72044-15 | Surgical Stainless Steel |
| Collagenase Type-1 filtered | Worthington Biochemical Corporation | #4214 | |
| Insulin syringe | BD | #329424 | |
| Accumax | EMD Millipore | #SCR006 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | |
| EGF | R&D | 2028-EG-200 | |
| FGF2 | R&D | 233-FB-025 | |
| B27 Supplement | Gibco | 10889-038 |
Riferimenti
- Sharpe, P. T., Young, C. S. Test-tube teeth.. Sci Am. 293, 34-41 (2005).
- D’Souza, R. N., Klein, O. D. Unraveling the molecular mechanisms that lead to supernumerary teeth in mice and men: Current concepts and novel approaches. Cells Tissues Organs. 186, 60-69 (2007).
- Jernvall, J., Thesleff, I. Tooth shape formation and tooth renewal: evolving with the same signals. Development. 139, 3487-3497 (2012).
- Yen, A. H., Yelick, P. C. Dental Tissue Regeneration A Mini-Review. Gerontology. 57, 85-94 (2011).
- Jheon, A. H., Seidel, K., Biehs, B., Klein, O. D. From molecules to mastication: the development and evolution of tooth development. WIREs Dev Biol. 2, 165-182 (2013).
- Wang, X. P., et al. An integrated gene regulatory network controls stem cell proliferation in teeth. PLoS Biol. 5, (2007).
- Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. J Cell Biol. 147, 105-120 (1999).
- Juuri, E., et al. Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors. Dev Cell. 23, 317-328 (2012).
- Seidel, K., et al. Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor. Development. 137, 3753-3761 (2010).
- Smith, C. E., Warshawsky, H. Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine. Anat Rec. 183, 523-561 (1975).
- Smith, C. E., Warshawsky, H. Quantitative analysis of cell turnover in the enamel organ of the rat incisor. Evidence for ameloblast death immediately after enamel matrix secretion. Anat Rec. 187, 63-98 (1977).
- Parsa, S., et al. Signaling by FGFR2b controls the regenerative capacity of adult mouse incisors. Development. 137, 3743-3752 (2010).
- Chang, J. Y., et al. Self-renewal and multilineage differentiation of mouse dental epithelial stem cells. Stem Cell Res. 11, 990-1002 (2013).
- Biehs, B., et al. Bmi1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor. Nat Cell Biol. 15, 846-852 (2013).
- Hwang, W. S., Tonna, E. A. Autoradiographic Analysis of Labeling Indices and Migration Rates of Cellular Component of Mouse Incisors Using Tritiated Thymidine (H3tdr). J Dent Res. 44, 42-53 (1965).
- Li, C. Y., et al. E-cadherin regulates the behavior and fate of epithelial stem cells and their progeny in the mouse incisor. Dev Biol. 366, 357-366 (2012).
- Smith, C. E. Cellular and chemical events during enamel maturation. Crit Rev Oral Biol Med. 9, 128-161 (1998).
- Lapthanasupkul, P., et al. Ring1a/b polycomb proteins regulate the mesenchymal stem cell niche in continuously growing incisors. Dev Biol. 367, 140-153 (2012).
- Chavez, M. G., et al. Characterization of dental epithelial stem cells from the mouse incisor with two-dimensional and three-dimensional platforms. Tissue Eng Part C Methods. 19, 15-24 (2013).
- Kawano, S., et al. Establishment of dental epithelial cell line (HAT-7) and the cell differentiation dependent on Notch signaling pathway. Connect Tissue Res. 43, 409-412 (2002).
- Briggaman, R. A., Abele, D. C., Harris, S. R., Wheeler, C. E. Preparation and characterization of a viable suspension of postembryonic human epidermal cells. J Invest Dermatol. 48, 159-168 (1967).
- Fusenig, N. E. Isolation and cultivation of epidermal cells from embryonic mouse skin. Naturwissenschaften. 58, 421 (1971).
- Fusenig, N. E., Worst, P. K. Mouse epidermal cell cultures. I. Isolation and cultivation of epidermal cells from adult mouse skin. J Invest Dermatol. 63, 187-193 (1974).
- Rheinwald, J. G., Green, H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell. 6, 331-343 (1975).
- Barrandon, Y., Green, H. Three clonal types of keratinocyte with different capacities for multiplication. Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 2302-2306 (1987).
- Blanpain, C., et al. Self-renewal, multipotency, and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche. Cell. 118, 635-648 (2004).
- Toma, J. G., et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat Cell Biol. 3, 778-784 (2001).
- Nowak, J. A., Fuchs, E. Isolation and culture of epithelial stem cells. Methods Mol Biol. 482, 215-232 (2009).
- Rheinwald, J. G., Green, H. Epidermal growth factor and the multiplication of cultured human epidermal keratinocytes. Nature. 265, 421-424 (1977).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
- Lesuisse, C., Martin, L. J. Long-term culture of mouse cortical neurons as a model for neuronal development, aging, and death. J Neurobiol. 51, 9-23 (2002).
- Felszeghy, S., Suomalainen, M., Thesleff, I. Notch signalling is required for the survival of epithelial stem cells in the continuously growing mouse incisor. Differentiation. 80, 241-248 (2010).
- Fujimori, S., et al. Wnt/beta-catenin signaling in the dental mesenchyme regulates incisor development by regulating Bmp4. Dev Biol. 348, 97-106 (2010).
- Klein, O. D., et al. An FGF signaling loop sustains the generation of differentiated progeny from stem cells in mouse incisors. Development. 135, 377-385 (2008).
