Yetişkin Fare insizör Diş Epitel Kök Hücreleri İzolasyon ve Kültür
Summary
Sürekli büyüyen fare kesici diş epitel kök hücreler (DESCs) diş dokularının yenilenmesini eğitim için bir model sağlar. Sürekli ve güvenilir bir şekilde kesici bu hücrelerin elde edilmesi ve in vitro ile genişletilmesi için sağlam bir sistem burada bildirilmektedir.
Abstract
Diş yenilenme ve yenileme altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaların anlaşılması büyük ilgi 1-4 bir konu haline, ve fare kesici, bu işlemler için bir model sağlar sahiptir. Bu olağanüstü organ hayvanın hayatı boyunca sürekli büyür ve (dil doğru) (dudağa doğru) labial ve lingual servikal döngü (CL) bölgeleri muhafaza yetişkin kök hücrelerin aktif havuzlarından gerekli tüm hücre tiplerini oluşturur. Labiyali CL sadece diş kök hücreler labiyali yüzeyinde emaye, dişlerin dış kaplama oluşturmak ameloblastlar sebebiyet verir. Bu asimetrik mine teşekkülü kesici ucunda aşınma sağlar ve proksimal dişe atalarıdır ve kök hücreler diş dokuları sürekli doldurulan emin olun. Bu in vitro progenitör veya kök hücreleri izole ve büyümek için yeteneğini kendi genişleme sağlar ve saat gibi in vivo elde değil çok sayıda deney, kapılarını açıyorpotansiyel kök hücre düzenleyici faktör üksek throughput testi. Burada, biz tarif ve fare kesici dişin labial CL kültür hücreleri güvenilir ve tutarlı bir yöntem ortaya koymaktadır.
Introduction
Omurgalıların eşsiz özelliklerinden biri diş evrimdir. Moleküler yollar ve bu organın ilgili morfolojik uzmanlık gelişim ve evrimsel biyologlar 5 de dahil olmak üzere, çeşitli açılardan incelenmiştir gibi diş, araştırma birçok alanda önemli bir model sistem haline gelmiştir. Daha yakın zamanda, rejeneratif tıp alanında bir model olarak diş kullanarak değerli bilgiler kazanmaya başladı. Özellikle, diş epitel kök hücrelerin keşif önemli bir ilerleme 6-13 olmuştur.
Tüm kemirgenler erişkin kök hücre yönetmeliği incelemek için, bu dişlere erişilebilir bir model sistemi yapım olan büyüme kök hücreleri tarafından körüklenen sürekli büyüyen kesicilerin sahip. Genetik soy izleme deneylerinde 8,9,12,14 ardından 1970'lerde 10,11 etiketleme deneyleri, DESCs kesici proksimal bölgesinde bulunan olduğunu göstermiştir. KökHücre labiyali servikal döngü (CL) olarak bilinen, varsayılan niş, dışarı labial yan hareket epitel bölmeye döl ve geçiş yalıtım (TA) hücreleri (Şekil 1) adı verilen bir hücre popülasyonuna katkıda bulunur. Özellikle, DESCs dış mine epiteli (OEE) ve Stellate retikulum (SR) 8,9,14 ikamet ve iç mine epiteli (IEE) sonra hareket hücre döngüsü sınırlı sayıda ilerlerken TA hücrelere yol açar ve distal kesici uzunluğu (Şekil 1) boyunca. Fare dişe ayırt ameloblastlar tek bir günde 15,16 yaklaşık 350 mikron dikkate değer bir oranda kesici dişin boyunca distale hareket devam ediyor. Onlar hareket ettikçe, hücrelerin olgun ameloblastlar ve stratum intermedium (SI) hücrelerin içine ayırt. Emaye matris tam kalınlık olarak biriktirilmesi sonra ameloblastlar birçok apoptoz geçirir, ve geriye kalan hücreler boyutu küçültmek ve emaye olgunlaşmasını düzenleme <> 17 sup. Gibi SR gibi Labiyal CL, diğer hücre tiplerinin soy daha az açıktır ve mezenşimin 18 ve lingual CL kök hücrelerin ilişkin veriler sadece ortaya çıkmaya başlıyor.
Fare modeli kullanılarak kesici, grup bir dizi genetik yollar ve doğal kök hücre bazlı bir organ yenilenmesine katılan hücre biyolojik süreçleri aydınlatmak için çalıştık. Bununla birlikte, dudak CL 5,000 birincil hücreler zorlu çalışma yapar kesici fare başına olduğu tahmin hücrelerin nispeten küçük bir sayısını ihtiva etmektedir. Bu nedenle, kültür çalışmaları yapılmış ve in vivo olarak elde olmayan deneysel yaklaşımlar için yeni kapılar açmak için in vitro 6,16,19,20 bu hücreleri genişletmek edilmiştir. En son çalışma, bu hücreler, kendini yenileme ve kültürlendiğinde 13 hücreleri ifade Amelogenin içine ayırt hem göstermiştir. Burada, th için bir yöntem tarif etmekte ve açıklamaktadırfare labiyali CL hücrelerin e güvenilir ve tutarlı bir kültürü.
Protocol
Representative Results
Discussion
Epitel hücreleri 40 yıl önce 21-24 başarıyla üzerinde ilk kültürlü idi, ve daha yakın zamanda, epitel kök hücrelerin 25-27 başarılı izolasyon epitel biyoloji bilgimizi ilerlemiştir. Biz yetişkin fare kesici dişlerinin DESCs, diş biyoloji ve mine oluşumuna dair önemli bilgiler verim potansiyeline sahip kök hücrelerin nispeten ilgili yeterli nüfusa izole etmek için bir protokol rapor. Bu protokol, ilk olarak kıl folikülü 28 epitel kök hücre izolasyonu daha ön…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar AZALAN kültürlerle ilk yardım için Xiu-Ping Wang teşekkür ederim. Yazarlar (OH MGC, K08-DE022377-02 AHJ, K12-GM081266 için K99-DE022059 ve ODK R01-DE021420) Ulusal Sağlık Enstitüleri burs ve hibe tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| Forceps, size 5 | Fine Science Tools | 11251-30 | FST by Dumont, Dumoxel, |
| Forceps Straight, fine, 3.5 | Roboz | RS5070 | |
| Razorblades | Electron Microscopy Services | #71960 | |
| Scalpel Handle No.3 | VWR | ||
| Feather Blade No. 15 | Electron Microscopy Services | #72044-15 | Surgical Stainless Steel |
| Collagenase Type-1 filtered | Worthington Biochemical Corporation | #4214 | |
| Insulin syringe | BD | #329424 | |
| Accumax | EMD Millipore | #SCR006 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | |
| EGF | R&D | 2028-EG-200 | |
| FGF2 | R&D | 233-FB-025 | |
| B27 Supplement | Gibco | 10889-038 |
Riferimenti
- Sharpe, P. T., Young, C. S. Test-tube teeth.. Sci Am. 293, 34-41 (2005).
- D’Souza, R. N., Klein, O. D. Unraveling the molecular mechanisms that lead to supernumerary teeth in mice and men: Current concepts and novel approaches. Cells Tissues Organs. 186, 60-69 (2007).
- Jernvall, J., Thesleff, I. Tooth shape formation and tooth renewal: evolving with the same signals. Development. 139, 3487-3497 (2012).
- Yen, A. H., Yelick, P. C. Dental Tissue Regeneration A Mini-Review. Gerontology. 57, 85-94 (2011).
- Jheon, A. H., Seidel, K., Biehs, B., Klein, O. D. From molecules to mastication: the development and evolution of tooth development. WIREs Dev Biol. 2, 165-182 (2013).
- Wang, X. P., et al. An integrated gene regulatory network controls stem cell proliferation in teeth. PLoS Biol. 5, (2007).
- Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. J Cell Biol. 147, 105-120 (1999).
- Juuri, E., et al. Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors. Dev Cell. 23, 317-328 (2012).
- Seidel, K., et al. Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor. Development. 137, 3753-3761 (2010).
- Smith, C. E., Warshawsky, H. Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine. Anat Rec. 183, 523-561 (1975).
- Smith, C. E., Warshawsky, H. Quantitative analysis of cell turnover in the enamel organ of the rat incisor. Evidence for ameloblast death immediately after enamel matrix secretion. Anat Rec. 187, 63-98 (1977).
- Parsa, S., et al. Signaling by FGFR2b controls the regenerative capacity of adult mouse incisors. Development. 137, 3743-3752 (2010).
- Chang, J. Y., et al. Self-renewal and multilineage differentiation of mouse dental epithelial stem cells. Stem Cell Res. 11, 990-1002 (2013).
- Biehs, B., et al. Bmi1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor. Nat Cell Biol. 15, 846-852 (2013).
- Hwang, W. S., Tonna, E. A. Autoradiographic Analysis of Labeling Indices and Migration Rates of Cellular Component of Mouse Incisors Using Tritiated Thymidine (H3tdr). J Dent Res. 44, 42-53 (1965).
- Li, C. Y., et al. E-cadherin regulates the behavior and fate of epithelial stem cells and their progeny in the mouse incisor. Dev Biol. 366, 357-366 (2012).
- Smith, C. E. Cellular and chemical events during enamel maturation. Crit Rev Oral Biol Med. 9, 128-161 (1998).
- Lapthanasupkul, P., et al. Ring1a/b polycomb proteins regulate the mesenchymal stem cell niche in continuously growing incisors. Dev Biol. 367, 140-153 (2012).
- Chavez, M. G., et al. Characterization of dental epithelial stem cells from the mouse incisor with two-dimensional and three-dimensional platforms. Tissue Eng Part C Methods. 19, 15-24 (2013).
- Kawano, S., et al. Establishment of dental epithelial cell line (HAT-7) and the cell differentiation dependent on Notch signaling pathway. Connect Tissue Res. 43, 409-412 (2002).
- Briggaman, R. A., Abele, D. C., Harris, S. R., Wheeler, C. E. Preparation and characterization of a viable suspension of postembryonic human epidermal cells. J Invest Dermatol. 48, 159-168 (1967).
- Fusenig, N. E. Isolation and cultivation of epidermal cells from embryonic mouse skin. Naturwissenschaften. 58, 421 (1971).
- Fusenig, N. E., Worst, P. K. Mouse epidermal cell cultures. I. Isolation and cultivation of epidermal cells from adult mouse skin. J Invest Dermatol. 63, 187-193 (1974).
- Rheinwald, J. G., Green, H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell. 6, 331-343 (1975).
- Barrandon, Y., Green, H. Three clonal types of keratinocyte with different capacities for multiplication. Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 2302-2306 (1987).
- Blanpain, C., et al. Self-renewal, multipotency, and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche. Cell. 118, 635-648 (2004).
- Toma, J. G., et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat Cell Biol. 3, 778-784 (2001).
- Nowak, J. A., Fuchs, E. Isolation and culture of epithelial stem cells. Methods Mol Biol. 482, 215-232 (2009).
- Rheinwald, J. G., Green, H. Epidermal growth factor and the multiplication of cultured human epidermal keratinocytes. Nature. 265, 421-424 (1977).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
- Lesuisse, C., Martin, L. J. Long-term culture of mouse cortical neurons as a model for neuronal development, aging, and death. J Neurobiol. 51, 9-23 (2002).
- Felszeghy, S., Suomalainen, M., Thesleff, I. Notch signalling is required for the survival of epithelial stem cells in the continuously growing mouse incisor. Differentiation. 80, 241-248 (2010).
- Fujimori, S., et al. Wnt/beta-catenin signaling in the dental mesenchyme regulates incisor development by regulating Bmp4. Dev Biol. 348, 97-106 (2010).
- Klein, O. D., et al. An FGF signaling loop sustains the generation of differentiated progeny from stem cells in mouse incisors. Development. 135, 377-385 (2008).
