Foldning og karakterisering af en Bio-responsiv Robot fra DNA Origami
Summary
DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).
Abstract
DNA nanorobot er en hul sekskantet nanometrisk enhed, der er designet til at åbne som svar på specifikke stimuli og nuværende last sekvestreret indeni. Både stimuli og gods kan skræddersys efter specifikke behov. Her beskriver vi DNA nanorobot fabrikation protokollen, med anvendelse af DNA origami teknik. Proceduren starter ved blanding af korte enkeltstrengede DNA-hæfteklammer i en bestand blanding, som derefter tilsættes til en lang, cirkulær, enkeltstrenget DNA stillads i nærværelse af en foldningsbuffer. En standard termo variator er programmeret til gradvist sænke blanding reaktionstemperatur at lette hæfteklammer-til-stillads annealing, hvilket er den ledende kraft bag foldningen af nanorobot. Når 60 timers folde reaktionen er fuldstændig, er overskydende hæfteklammer kasseres under anvendelse af en centrifugal filter, efterfulgt af visualisering via agarose-gelelektroforese (AGE). Endelig er en vellykket fremstilling af nanorobot verificeret ved transmissionselektronmikroskopi (TEM),med anvendelse af uranyl-formiat som negativ plet.
Introduction
Anvendelserne for nukleinsyrer nanoteknologi er forbløffende. Sporbarhed af Watson-Crick baseparring samt den lethed og relative lave omkostninger af store syntese af skræddersyede oligoer 2 har genereret en eksplosion af applikationer 3 og forskning inden for DNA-nanoteknologi. Strukturel DNA nanoteknologi, baseret på det immobile Seeman krydset 4,5 som en grundlæggende byggesten gør brug af DNA som en selvstændig samling elementære enhed til opførelse af vilkårlige figurer 6-8.
Den seneste udvikling i afstivet DNA origami 9 teknik giver mulighed for opførelse af komplekse 2D / 3D nano-arkitekturer 10-12 med sub-nanometer præcision og er en effektiv vej til at bygge nye funktionelle objekter med stigende kompleksitet og forbløffende mangfoldighed. Byggeprocessen er baseret på en lang stillads enkeltstrenget DNA, sædvanligvis afledt af et viralt genombetegnet e, som kan foldes gennem hybridisering af hundredvis af korte enkeltstrengede DNA-oligoer hæfteklammer. Den høje strukturelle opløsning fremstillet ved denne teknik er en direkte følge af de naturlige dimensioner af DNA dobbelt helix, mens reproducerbarheden af fremstillingen er resultatet af at skræddersy de korte enkeltstrengede korte sekvenser for at lette maksimal hydrogenbinding komplementaritet opnås. Med brug af en langsom temperatur annealing rampe designet laveste energi, termodynamisk foretrukne nanostruktur er nået i høje udbytter og fidelity. Den nemme implementering af junction design regler i en computer-kode muliggjort udviklingen af CAD-værktøjer, såsom caDNAno 13, at ekstremt forenkle opgaven med at designe store, komplekse strukturer, der indeholder hundredvis af tilsluttede vejkryds.
Tidligere beskrev vi udformningen af en DNA nanorobot ved hjælp af caDNAno værktøjet 14,15. Her skildrer vi fabrikation ogvisualisering, via transmission elektronmikroskopi (TEM), i nanorobot, en 3D-hule sekskantet nanodevice, med dimensioner på 35 x 35 x 50 nm 3, designet til at gennemgå en større konformationsændring som reaktion på en forudbestemt påvirkning og nuværende specifikke fragt, såsom proteiner eller nucleinsyre-oligoer, afsondret indenfor. Mens 12 ladestationer er tilgængelige inde i det hule chassis, det faktiske antal containere, afviger med last størrelse. Lastmolekyler spænder fra små DNA-molekyler til enzymer, antistoffer og 5-10 nm guld nanopartikler. Cargocan enten være ensartet eller uensartet, således at hver nanorobot indeholder en blanding af forskellige molekyler. Sensing opnås via to dobbelt spiralformet låsning porte design til fornemme proteiner, nukleinsyrer eller andre kemikalier, baseret på enten aptasensor 16,17 eller DNA-streng forskydning 18 teknologier. Den seneste udvikling i aptamer selektionsprotokoller 19-21 gøre udformningen af nanorobotter reageretil en stadigt stigende vifte af molekyler og celletyper.
Tidligere arbejde viste en nanorobot bærer et specifikt antistof, som ved binding til dets antigen kan viderebringe enten en inhibitorisk eller en produktiv signal til indersiden af specifikke celletyper i en blandet cellepopulation 15. En spændende træk ved disse nanodevices er deres evne til at udføre endnu mere komplekse opgaver og logik kontrol med indførelsen af forskellige nanorobot undertyper i en enkelt population. For nylig demonstrerede vi specifikke undertyper af nanorobotter udfører som enten positive eller negative regulatorer, kontrollerer en effektor befolkning indeholder et aktivt fragt molekyle 22.
Protokollen præsenteres her beskriver fremstilling, rensning og billeddannelse af en nanorobot gated med aptamer sensor sekvenser, som binder selektivt til PDGF for at lette åbningen af nanorobot 15,22. Fabrikationsprocessen beskrevne svarer til nanorobot produktionsprocessen oprindeligt afbildet af Douglas et al. 15 med ændringer med henblik på den samlede proces varighed reducere, og samtidig øge udbyttet og rensning satser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskrev fremstilling, oprensning og visualisering af DNA nanorobot. Efter fremstilling af den sekskantede chassis af enheden, er funktionen af nanorobot programmeret med den enkle indførelse af specifikke last og sensing tråde til robotten, som let finde deres udpegede position på grund af brint-bonding komplementaritet med tilgængelige enkeltstrengede docking sites 14 , 15,22.
Fremstillingen beskrevne protokol anvender en langsom annealing rampe, som almindeligvis anvendes…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke S. Douglas for ekstremt værdifulde diskussioner og rådgivning, og alle medlemmer af Bachelet laboratorium for nyttige diskussioner og arbejde. Dette arbejde er støttet af tilskud fra Det Biovidenskabelige Fakultet og Institut for Nanoteknologi & Advanced Materials ved Bar-Ilan University.
Materials
| DNase/RNase free distilled water | Gibco | 10977 |
| M13mp18 ssDNA scaffold | NEB | N4040S |
| 10x TAE | Gibco | 15558-042 |
| 1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter 100K MWCO | Amicon | UFC510024 |
| Agarose | Promega | V3125 |
| TBE buffer | Promega | V4251 |
| Ethidium bromide 10mg/ml solution | Sigma Aldrich | E1510 |
| 1 kb DNA marker | NEB | N3232S |
| Loading Dye | NEB | B7021S |
| uranyl formate | polysciences | 24762 |
| carbon-coated TEM grids | Science services | EFCF400-Cu-50 |
| Thermal Cycler c1000 Touch | Bio-Rad | |
| Glow Discharge K100X | Emitech | |
| UV table Gel Doc EZ Imager | Bio-Rad | |
| NanoDrop 2000c | Thermo Scientific | |
| TEM FEI-G12 | Tecnai |
Riferimenti
- Watson, J. D., Crick, F. H. Genetical implications of the structure of deoxyribonucleic acid. Nature. 171, 964-967 (1953).
- Kosuri, S., Church, G. M. Large-Scale de novo. DNA synthesis: technologies and applications. Nature Meth. 11 (5), 499-507 (2014).
- Pinheiro, A. V., Han, D., Shih, W. M., Yan, H. Challenges and opportunities for structural DNA nanotechnology. Nature Nanotech. 6 (12), 763-772 (2011).
- Seeman, N. C. Nucleic acid junctions and lattices. J Theor Biol. 99 (2), 237-247 (1982).
- Chen, J. H., Seeman, N. C. Synthesis from DNA of a molecule with the connectivity of a cube. Nature. 350 (6319), 631-633 (1991).
- Wei, B., Dai, M., Yin, P. Complex shapes self-assembled from single-stranded DNA tiles. Nature. 485 (7400), 623-626 (2012).
- He, Y., et al. Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra. Nature. 452 (7184), 198-201 (2008).
- Yin, P., Hariadi, R. F., Sahu, S., Choi, H. M. T., Park, S. H., Labean, T. H., Reif, J. H. Programming DNA tube circumferences. Science. 321 (5890), 824-826 (2008).
- Rothemund, P. W. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
- Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325 (5941), 725-730 (2009).
- Douglas, S. M., et al. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).
- Zhang, F., Nangreave, J., Liu, Y., Yan, H. Structural DNA nanotechnology: state of the art and future perspective. J Am Chem Soc. 136 (32), 11198-11211 (2014).
- Douglas, S. M., et al. Prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno. Nucleic Acids Res. 37 (15), 5001-5006 (2009).
- Ben-Ishay, E., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. Designing a bio-responsive robot from DNA origami. J Vis Exp. (77), e50268 (2013).
- Douglas, S. M., Bachelet, I., Church, G. M. A logic-gated nanorobot for targeted transport of molecular payloads. Science. 335 (6070), 831-834 (2012).
- Tan, W., Donovan, M. J., Jiang, J. Aptamers from cell-based selection for bioanalytical applications. Chem Rev. 113 (4), 2842-2862 (2013).
- Xiang, D., et al. Nucleic Acid Aptamer-Guided Cancer Therapeutics and Diagnostics: The Next Generation of Cancer Medicine. Theranostics. 5 (1), 23-42 (2015).
- Zhang, D. Y., Seelig, G. Dynamic DNA nanotechnology using strand-displacement reactions. Nat Chem. 3 (2), 103-113 (2011).
- Tang, Z., Parekh, P., Turner, P., Moyer, R. W., Tan, W. Generating aptamers for recognition of virus-infected cells. Clin Chem. 55 (4), 813-822 (2009).
- Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O’Donoghue, M. B., Tan, W. Development of DNA aptamers using Cell-SELEX. Nature Prot. 5 (6), 1169-1185 (2010).
- McKeague, M., DeRosa, M. C. Challenges and Opportunities for Small Molecule Aptamer Development. J Nucleic Acids. 2012, (2012).
- Amir, Y., et al. Universal computing by DNA origami robots in a living animal. Nature Nanotech. 9 (5), 353-357 (2014).
- Castro, C. E., et al. A primer to scaffolded DNA origami. Nature Meth. 8 (3), 221-229 (2011).
- Sobczak, J. P., Martin, T. G., Gerling, T., Dietz, H. Rapid folding of DNA into nanoscale shapes at constant temperature. Science. 338 (6113), 1458-1461 (2012).
- Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. Facile and scalable preparation of pure and dense DNA origami solutions. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (47), 12735-12740 (2014).
- Lin, C., Perrault, S. D., Kwak, M., Graf, F., Shih, W. M. Purification of DNA-origami nanostructures by rate-zonal centrifugation. Nucleic Acids Res. 41 (2), (2012).
- Bai, X. C., Martin, T. G., Scheres, S. H., Dietz, H. Cryo-EM structure of a 3D DNA-origami object. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (49), 20012-20017 (2012).
